（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢精神衛(wèi)生中心 精神科，湖北 武漢 430022）

抑郁癥是一種常見的心境和認知功能障礙性疾病，發(fā)病率高。維持海馬神經(jīng)細胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡有助于緩解抑郁癥的惡化。研究表明，長期缺乏運動是導(dǎo)致抑郁癥的主要因素之一[1]。采用運動療法治療精神疾病和腦疾病療效較好[2]。因此，本實驗研究運動聯(lián)合帕羅西汀對抑郁癥大鼠行為學(xué)、海馬細胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷的影響及其作用機制，為抑郁癥的治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　主要試劑

帕羅西?。ㄅ_州海辰藥業(yè)有限公司），膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide,PI）凋亡檢測試劑盒（美國羅氏公司），活性氧（reactive oxygen species,ROS）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fatal bovine serum,FBS）購自美國Gibco公司，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）一抗、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（phosphorylation extracellular regulated protein kinases,pERK）一抗、神經(jīng)肽（Neuropeptide,VGF）一抗購自美國Santa Cruz公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2　方法

1.2.1大鼠抑郁模型的復(fù)制68只健康成年雄性SD大鼠由湖北省實驗動物中心提供，安靜飼養(yǎng)3 d后進行7 d的跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練，將不愛運動的8只大鼠去掉。參照趙立波[3]和王瓏等[4]的模型復(fù)制方法，采用慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)法復(fù)制慢性應(yīng)激抑郁模型：第1天禁食24 h，第2天夾尾3 min，第3天0℃游泳5 min，第4天水平振蕩2 min，第5天晝夜顛倒，第6天禁食24 h，第7天45℃溫箱熱烘5 min，第8天禁水24 h，第9天45℃溫箱熱烘5 min，第10天禁食24 h，第11天晝夜顛倒，第12天0℃游泳5 min，第13天水平振蕩2 min，第14天夾尾3 min，第15天禁水24 h，第16天0℃游泳5 min，第17天夾尾3 min，第18天45℃溫箱熱烘5 min，第19天晝夜顛倒，第20天禁食24 h，第21天水平振蕩2 min，將抑郁大鼠單獨飼養(yǎng)。模型復(fù)制結(jié)束后觀察行為學(xué)試驗作為缺乏快感的客觀指標，判定模型是否復(fù)制成功。

1.2.2實驗分組根據(jù)體重均衡的原則將實驗分為5組：對照組、模型組、運動組、給藥組、聯(lián)合組，每組12只。對照組為正常飼養(yǎng)的大鼠，其余均接受21 d的CUMS。模型復(fù)制同時，給藥組、聯(lián)合組大鼠每次應(yīng)激前灌胃10 mg/kg帕羅西汀，對照組、運動組大鼠給予等量的生理鹽水；運動組、聯(lián)合組每天上午以轉(zhuǎn)輪跑的方式進行訓(xùn)練，運動量為跑速10 m/min，30 min/次，1 次 /d[5]。

1.2.3行為學(xué)試驗①糖水實驗：應(yīng)激0、7、14和21 d測量剝奪飲水24 h后大鼠1 h內(nèi)的糖水消耗量，糖水的飲用量反映大鼠快感反應(yīng)。②Morris水迷宮實驗：將大鼠置于Morris水迷宮中，水溫控制在24～26℃，記錄大鼠的逃避潛伏期，即在1 min內(nèi)找到透明平臺的時間，循環(huán)5次/d，連續(xù)測試3 d，取平均數(shù)為大鼠空間學(xué)習(xí)記憶成績。

1.2.4流式細胞術(shù)將大鼠麻醉后斷頭取出腦組織，在冰盤上分離出右側(cè)海馬，采用酶消化法收集細胞，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml。取1 ml細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml預(yù)冷PBS重懸細胞，重復(fù)3次，加入10μl Annexin V-FITC和5μl PI輕輕振蕩混勻，4℃避光染色20 min，采用流式細胞儀檢測4組大鼠海馬細胞凋亡率。

1.2.5DCFH-DA法采用DCFH-DA法檢測細胞中ROS的含量。細胞懸浮液的制作方法同1.2.4。培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌2次，重懸使細胞濃度調(diào)整為1.5×105個/ml，取2 ml接種至6孔板上，每孔加入濃度為10μmol/L的DCFH-DA探針，37℃避光培養(yǎng)30 min，棄去DCFH-DA，使用無血清的培養(yǎng)液洗滌細胞3次，離心收集細胞，加入100μl PBS重懸細胞，檢測485/535 nm波長處的熒光值。

1.2.6Western blot檢測將應(yīng)激結(jié)束后的大鼠斷頭取腦組織，冰上分理出海馬，置于液氮中迅速冷凍，放入-80℃冰箱中保存。實驗時取出海馬組織，加入組織裂解液，振蕩混勻，置于冰上裂解30 min，離心取上清，按BCA試劑盒說明書進行操作，檢測蛋白的表達水平。在蛋白樣品中加入上樣緩沖液稀釋，沸水浴5 min，根據(jù)目的蛋白配置相應(yīng)濃度的分離膠和5%濃縮膠進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待溴酚藍遷移至凝膠底部，停止電泳，經(jīng)浸漬轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用3% FBS封閉液4℃過夜，加入稀釋好的一抗，置于搖床上4℃孵育過夜，PBS緩沖液清洗3次，10 min/次，加入二抗，室溫孵育1 h，PBS緩沖液清洗3次，10 min/次，加入增強化學(xué)發(fā)光法顯色液，暗室中曝光，定影液中浸泡5 min，凝膠成像系統(tǒng)中測定蛋白的灰度值。以目的條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值為pERK、BDNF、VGF蛋白的相對表達量。

1.3　統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　運動聯(lián)合帕羅西汀對大鼠行為學(xué)的影響

2.1.1運動聯(lián)合帕羅西汀對各組大鼠不同時間糖水飲用量的影響對照組、模型組、運動組、給藥組、聯(lián)合組大鼠應(yīng)激0、7、14和21d的糖水飲用量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的糖水飲用量有差別（F=9.238，P=0.000）；②4組大鼠糖水飲用量有差別（F=6.932，P=0.003）；③4組糖水飲用量變化趨勢有差別（F=8.742，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組大鼠7、14和21 d的糖水消耗量較對照組降低（t=4.405、7.214和11.135，均P=0.000），提示大鼠抑郁模型復(fù)制成功。運動組、給藥組、聯(lián)合組大鼠14和21 d的糖水消耗量較模型組增加（P＜0.05）；聯(lián)合組大鼠21 d的糖水消耗量較運動組、給藥組增加（t=2.846和2.927，P=0.009和0.008），提示運動和給藥可一定程度上增加大鼠的糖水飲用量，緩解抑郁大鼠的快感缺乏，且聯(lián)合作用效果高于單獨使用。見表1。

表1　運動聯(lián)合帕羅西汀對各組大鼠不同時間糖水飲用量的影響（n=12，g，±s）

表1　運動聯(lián)合帕羅西汀對各組大鼠不同時間糖水飲用量的影響（n=12，g，±s）

組別　0 d　7 d　14 d　21 d對照組　63.4±12.2　66.5±8.5　72.4±9.4　79.6±8.4模型組　62.7±16.4　50.1±9.7　48.6±6.5　47.5±5.4運動組　60.7±13.4　55.7±10.2　59.6±11.5　61.8±6.7給藥組　60.1±16.4　54.6±7.4　57.5±9.4　60.7±8.2聯(lián)合組　64.2±16.9　56.3±8.5　62.3±10.1　70.5±8.2

2.1.2運動聯(lián)合帕羅西汀對各組大鼠空間記憶學(xué)習(xí)的影響對照組、模型組、運動組、給藥組、聯(lián)合組大鼠應(yīng)激0、7、14和21 d的大鼠空間記憶學(xué)習(xí)能力比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的逃避潛伏期有差別（F=11.291，P=0.000）；②4組大鼠逃避潛伏期有差別（F=14.357，P=0.000）；③4組大鼠逃避潛伏期變化趨勢有差別（F=9.637，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組大鼠7、14和21 d的逃避潛伏期較對照組延長（t=6.931、9.923和14.763，均P=0.000），表明大鼠空間記憶學(xué)習(xí)增強，糖水消耗結(jié)果一致，也提示本實驗抑郁模型復(fù)制成功。運動組、給藥組大鼠21 d逃避潛伏期較模型組縮短（t=5.612和7.720，均P=0.000）；聯(lián)合組14和21 d逃避潛伏期較模型組縮短（t=14.460，P=0.000）。聯(lián)合組大鼠14和21 d逃避潛伏期較給藥組、運動組縮短（P＜0.05），提示運動和給藥在14 d后可縮短大鼠逃避潛伏期，聯(lián)合使用效果優(yōu)于單獨使用。見表2。

表2　運動聯(lián)合帕羅西汀對各組大鼠不同時間逃避潛伏期的影響（n=12，s，±s）

表2　運動聯(lián)合帕羅西汀對各組大鼠不同時間逃避潛伏期的影響（n=12，s，±s）

組別　0 d　7 d　14 d　21 d對照組　33.4±6.3　28.1±5.4　23.4±4.5　20.1±5.3模型組　34.5±6.4　43.1±5.2　48.7±7.6　53.9±5.6運動組　35.4±6.2　42.3±5.2　45.2±5.3　40.0±6.5給藥組　35.4±7.1　40.4±8.3　42.1±6.2　38.3±4.2聯(lián)合組　34.2±4.5　38.4±6.5　33.4±6.3　28.3±2.5

2.2　運動聯(lián)合帕羅西汀對大鼠海馬細胞凋亡的影響

對照組、模型組、運動組、給藥組、聯(lián)合組大鼠海馬細胞凋亡率分別為（10.5±1.7）%、（48.5±6.7）%、（35.1±5.9）%、（23.6±5.7）% 和（22.6±6.1）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=81.300，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組、運動組、給藥組、聯(lián)合組大鼠海馬細胞凋亡率高于對照組（t=19.044、13.879、7.629和6.619，均P=0.000）；運動組、給藥組、聯(lián)合組細胞凋亡率低于模型組（t=19.044、13.879和7.629，均P=0.000）；運動組細胞凋亡率高于給藥組（t=4.856，P=0.000）；聯(lián)合組細胞凋亡率低于運動組（t=5.102，P=0.000）。提示抑郁癥提高大鼠海馬細胞的凋亡率，運動和給藥可降低抑郁大鼠海馬細胞的凋亡率，聯(lián)合使用緩解細胞凋亡，可改善抑郁癥。見圖1。

圖1　運動聯(lián)合帕羅西汀對各組大鼠海馬細胞凋亡的影響

2.3　運動聯(lián)合帕羅西汀對大鼠海馬細胞ROS的影響

對照組、模型組、運動組、給藥組、聯(lián)合組大鼠海馬細胞ROS的相對表達量分別為（1.0±0.1）、（4.8±0.9）、（3.2±0.8）、（2.5±0.7） 和（2.3±0.4），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=54.967，P=0.000）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組、運動組、給藥組、聯(lián)合組大鼠海馬細胞ROS高于對照組（P＜0.05）；運動組、給藥組、聯(lián)合組大鼠海馬細胞ROS低于模型組（t=4.603、6.988和8.793，均P=0.000）；運動組大鼠海馬細胞ROS高于給藥組（t=2.218，P=0.033）；聯(lián)合組大鼠海馬細胞ROS低于運動組（t=3.486，P=0.002）。提示抑郁大鼠氧化損傷增加，運動和給藥可抑制氧化應(yīng)激損傷，聯(lián)合治療優(yōu)于單獨作用。

2.4　運動聯(lián)合帕羅西汀對大鼠海馬pERK、BDNF、VGF蛋白表達的影響

4組大鼠海馬海馬pERK、BDNF、VGF蛋白表達水平比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經(jīng)LSD-t檢驗，模型組大鼠海馬pERK、BDNF、VGF蛋白表達水平低于對照組（t=9.798、9.798和7.349，均P=0.000）；運動組、給藥組、聯(lián)合組大鼠海馬pERK、BDNF、VGF蛋白表達水平高于模型組（P＜0.05）；運動組pERK蛋白表達水平高于給藥組（t=17.146，P=0.000），運動組BDNF、VGF蛋白表達水平低于給藥組（t=4.899和2.450，P=0.000和0.023）；聯(lián)合組pERK、BDNF、VGF蛋白表達水平高于給藥組（t=6.794、4.201和4.382，均P=0.000）；聯(lián)合組pERK、BDNF、VGF蛋白表達水平高于運動組（t=2.228、5.881和5.477，P=0.046、0.000和0.000）。提示抑郁大鼠抑制BDNF、pERK、VGF的表達，運動聯(lián)合給藥逆轉(zhuǎn)BDNF/pERK細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其靶基因的含量優(yōu)于單一運動療法或藥物治療。見圖2和表3。

表3　運動聯(lián)合帕羅西汀對各組大鼠海馬pERK、BDNF、VGF 蛋白表達的影響（n=12，±s）

表3　運動聯(lián)合帕羅西汀對各組大鼠海馬pERK、BDNF、VGF 蛋白表達的影響（n=12，±s）

組別　pERK　BDNF　VGF對照組　0.7±0.1　0.8±0.1　0.8±0.1模型組　0.3±0.1　0.4±0.1　0.5±0.1運動組　1.2±0.1　0.6±0.1　0.7±0.1給藥組　0.5±0.1　0.8±0.1　0.8±0.1聯(lián)合組　1.5±0.5　1.3±0.4　1.2±0.3F值　51.310　33.600　30.000P值　0.000　0.000　0.000

圖2　各組大鼠海馬pERK、BDNF、VGF蛋白的表達

3　討論

近年來，隨著生活水平的提高、節(jié)奏的加快，全球＞9億人患有抑郁癥，且發(fā)病率逐年升高，僅次于心臟病。目前針對抑郁癥的治療藥物一般起效較慢，有效性也不高，對于部分難治性抑郁癥更是束手無策。長期缺乏鍛煉可導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生，是抑郁癥產(chǎn)生的重要影響因素。有研究表明，很少從事體力勞動的人患精神疾病的概率明顯高于經(jīng)常從事體力鍛煉的人[6]。臨床研究也顯示，運動對精神患者的治療和康復(fù)療效較好[7]，而且體育鍛煉結(jié)合藥物的療效遠遠高于單一藥物治療[8]，但是其作用機制尚不完全清楚。應(yīng)激性事件是誘發(fā)抑郁癥的主要因素之一，應(yīng)激可引起機體諸多功能障礙，如認知功能、消化功能、情緒障礙等。CUMS是近年來研究抑郁癥作用機制、藥物研發(fā)與使用等功能時最常用的抑郁動物模型之一，可模擬抑郁癥患者的快感缺失和行為絕望等核心癥狀。帕羅西汀是一種新型的抗抑郁藥物，起效快，耐受性好，能夠有效改善抑郁癥狀[9]。

本研究通過復(fù)制CUMS抑郁模型大鼠，觀察運動聯(lián)合抗抑郁藥物對大鼠行為學(xué)的影響。通過糖水Morris水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠糖水消耗量降低，逃避潛伏期延長，表明抑郁大鼠模型復(fù)制成功，快感缺乏。慢性應(yīng)激同時給予運動或藥物中的一種或者聯(lián)合使用可改善該核心癥狀，其中藥物聯(lián)合運動的緩解效果較好。

抑郁癥的發(fā)病機制和抗抑郁藥物的研發(fā)與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白或者靶基因關(guān)系密切，其中BDNF是最重要的影響因子之一。BDNF通過激活酪氨酸激酶受體B和有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)，影響抑郁癥的病理生理結(jié)構(gòu)和細胞功能。BDNF表達量可影響海馬神經(jīng)細胞的凋亡率。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）是MAPKs的一個亞族，分為ERK1、ERK2、ERK3等多種亞型，其中腦組織中以ERK1、ERK2為主，統(tǒng)稱為ERK1/2，是MAPK信號級聯(lián)的重要蛋白之一。ERK1/2水平降低可促進抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展。ERK磷酸化后可激活胞漿內(nèi)底物和轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB，調(diào)控細胞的增殖、凋亡，以及促進下游因子BDNF的表達[10]。VGF最早是作為神經(jīng)生長因子在PC12細胞中誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物而被發(fā)現(xiàn)的。近年來研究證明，VGF主要通過作為BDNF的靶基而發(fā)揮抗抑郁作用[11-12]。本實驗通過流式細胞術(shù)檢測海馬細胞凋亡率和DCFH-DA法檢測ROS水平，發(fā)現(xiàn)CUMS抑郁模型大鼠海馬細胞ROS和凋亡率增加，運動、給藥單獨或者聯(lián)合使用均可降低細胞ROS和凋亡率，緩解氧化應(yīng)激損傷；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，慢性刺激降低海馬細胞中BDNF、pERK、VGF的表達量，運動和抗抑郁藥物具有緩解BDNF、pERK、VGF表達量降低的作用，但運動聯(lián)合藥物逆轉(zhuǎn)BDNF、pERK、VGF表達量優(yōu)于單一運動療法或抗抑郁藥物治療，其可能是通過運動和抗抑郁藥物增強pERK的表達，進而上調(diào)BDNF，從而調(diào)控下游靶基因VGF的水平，發(fā)揮抗抑郁效果。

總之，運動聯(lián)合抗抑郁藥物帕羅西汀能夠有效緩解慢性應(yīng)激引起的抑郁癥狀，逆轉(zhuǎn)大鼠快感缺乏，降低海馬細胞凋亡率和氧化應(yīng)激損傷，其作用機制可能是通過BDNF/pERK信號通路，調(diào)控下游靶基因的表達而發(fā)揮作用。