高力揚(yáng),李錦宏,陳兵,楊帆,岑學(xué)程,廖壯檳,龍霄翱,王思捷
(1.寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,寧夏 銀川 750021;2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科,廣東 湛江 524001;3.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床研究中心,廣東 湛江 524001)
膠質(zhì)瘤占腦部惡性腫瘤的60%,世界衛(wèi)生組織神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)將其分為低級(jí)別和高級(jí)別,高級(jí)別膠質(zhì)瘤中位生存時(shí)間只有10~15個(gè)月。膠質(zhì)瘤主要的治療手段是最大安全范圍內(nèi)手術(shù)切除腫瘤[1]。由于膠質(zhì)瘤具有侵襲性的自然特性,手術(shù)治療后必須行放化療。放射治療致力于控制或者殺滅術(shù)后殘留的腫瘤細(xì)胞,而化學(xué)藥物治療帶來(lái)的損傷和腫瘤輻射抗性影響其療效[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞信號(hào)通路可能參與膠質(zhì)瘤輻射抗性[3-6]。因此研究膠質(zhì)瘤輻射抗性產(chǎn)生的機(jī)制對(duì)當(dāng)前臨床治療有重要意義。
細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(cell counting Kit-8,CCK-8)(上海碧云天生物技術(shù)研究所),IWR-1-endo抑制劑(美國(guó)Selleck Chemicals公司),雙抗含青霉素、鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)購(gòu)于美國(guó)Gibco公司,巢蛋白(Nestin)、β微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、CD133及Ki-67抗體購(gòu)于北京中杉金橋公司。德國(guó)Leica公司的DMI3000B熒光顯微鏡、日本電子株式會(huì)社的JEM-1400+GATAN CCD832投射電子顯微鏡由廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床研究中心提供,瑞典Eleketa公司的直線加速器由廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院放療科提供。
1.2.1U87細(xì)胞系的培養(yǎng)及誘導(dǎo)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株復(fù)蘇后,加入含有雙抗(青霉素50μ/ml,鏈霉素50 mg/ml)和10% FBS的DMEM高糖型培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)培養(yǎng)期后,取1/3細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng),或者取1×106個(gè)細(xì)胞加入1 ml凍存液(80%完全培養(yǎng)基+100μl FBS+100μl二甲基亞砜)于-80℃超低溫冰箱中短期凍存。用濃度為5μmol/L的Wnt信號(hào)通路抑制劑IWR-1-endo處理細(xì)胞2 d,收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。
1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。消化收集對(duì)照組、照射組和IWR-1-endo聯(lián)合照射組細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為15 000個(gè)/ml,取100μl細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中。48 h后,每孔加入10μl CCK-8,放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2~4 h,測(cè)定450 nm處吸光度值,并利用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線計(jì)算各組貼壁細(xì)胞數(shù)。
1.2.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn)0.25%胰蛋白酶分別消化對(duì)照組、照射組和IWR-1-endo聯(lián)合照射組,將3組細(xì)胞分別計(jì)數(shù),按500個(gè)/皿的密度接種細(xì)胞于60 mm培養(yǎng)皿中,靜置培養(yǎng)1周。待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí),無(wú)水甲醛固定細(xì)胞30 min,除去固定液后加入結(jié)晶紫染色10 min,用流水溫和洗脫染色液,倒置干燥培養(yǎng)皿。肉眼計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù),以克隆形成率表示細(xì)胞生長(zhǎng)情況,克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。
1.2.4細(xì)胞免疫熒光染色將細(xì)胞接種于24孔板培養(yǎng),IWR-1-endo處理2 d后,用磷酸鹽緩沖溶液漂洗細(xì)胞,4%多聚甲醛固定30 min,10%聚乙二醇辛基苯基醚通透后加入10%羊血清的封閉液處理30 min,加入一抗4℃孵育過(guò)夜,二抗室溫下孵育2 h后加入4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚核染,于DMI3000B熒光顯微鏡下觀察拍照。Nestin、GFAP、β-tubulin Ⅲ、CD133及Ki-67抗體用于人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的鑒定。
1.2.5細(xì)胞放療抵抗實(shí)驗(yàn)采用直線加速器X射線照射,照射劑量率為4 Gy/min。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,于100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行放射實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和照射組,照射組照射劑量為4 Gy。照射后更換細(xì)胞培養(yǎng)液,12 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。
1.2.6透射電鏡4%異丙酮固定細(xì)胞后環(huán)氧樹(shù)脂包埋切片,甲苯胺藍(lán)染色,銅網(wǎng)法JEM-1400+GATAN CCD832投射電子顯微鏡觀察細(xì)胞。
1.2.7蛋白提取取培養(yǎng)48 h后細(xì)胞,添加1 mmol/L苯甲基磺酰氟的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,并用細(xì)胞刮刀收集裂解液于1.5 ml離心管中。充分溶解后,10 319 r/min離心5 min,用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較用t檢驗(yàn)或方差分析,組間比較用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
為驗(yàn)證U87細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種特性,而且有較強(qiáng)的增殖活性,筆者選取神經(jīng)上皮干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP、神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulin Ⅲ、干細(xì)胞和膠質(zhì)瘤標(biāo)志物CD133及增殖細(xì)胞相關(guān)核抗原Ki-67對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞進(jìn)行鑒定(見(jiàn)圖1)。
分別提取照射組和對(duì)照組細(xì)胞中的蛋白,用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin的表達(dá),并使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。對(duì)照組β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量為(0.414±0.012),照射組β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(0.097±0.003),經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.420,P=0.000),照射組β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(見(jiàn)圖2)。
用5μmol/L濃度的IWR-1-endo處理U87細(xì)胞進(jìn)行輻射實(shí)驗(yàn)。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞數(shù)為(195 200±5 100)個(gè),IWR-1-endo聯(lián)合照射組細(xì)胞數(shù)為(94 234±3 394)個(gè),兩組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.790,P=0.000),IWR-1-endo聯(lián)合照射組U87細(xì)胞增殖能力減弱(見(jiàn)圖3A)。照射組、對(duì)照組及IWR-1-endo聯(lián)合照射組細(xì)胞增殖個(gè)數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=673.700,P=0.000)。進(jìn)一步組間兩兩比較,經(jīng)LSD-t檢驗(yàn),對(duì)照組與照射組細(xì)胞數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=32.260,P=0.000),對(duì)照組與IWR-1-endo聯(lián)合照射組細(xì)胞數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=30.080,P=0.000),照射組與IWR-1-endo聯(lián)合照射組細(xì)胞數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。照射組和IWR-1-endo聯(lián)合照射組比對(duì)照組U87細(xì)胞增殖個(gè)數(shù)少。而照射組和IWR-1-endo聯(lián)合照射組的比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖 3B)。
圖1 人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的鑒定
圖2 對(duì)照組和照射組細(xì)胞中 β-catenin的表達(dá)
平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示,IWR-1-endo聯(lián)合照射組的細(xì)胞克隆形成率為(0.360±0.050)%,對(duì)照組細(xì)胞克隆形成率為(0.770±0.110)%,經(jīng)t檢驗(yàn),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.513,P=0.005),IWR-1-endo聯(lián)合照射組細(xì)胞克隆形成率降低(見(jiàn)圖3C)。照射組、對(duì)照組及IWR-1-endo聯(lián)合照射組細(xì)胞克隆形成率比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=46.810,P=0.0002)。進(jìn)一步兩兩比較,經(jīng)LSD-t檢驗(yàn),對(duì)照組與照射組細(xì)胞克隆形成率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.589,P=0.002),對(duì)照組與 IWR-1-endo聯(lián)合照射組細(xì)胞克隆形成率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.915,P=0.010),照射組與IWR-1-endo聯(lián)合照射組細(xì)胞克隆形成率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.674,P=0.035)。照射組和IWR-1-endo聯(lián)合照射組比對(duì)照組的U87細(xì)胞克隆形成率低,而IWR-1-endo聯(lián)合照射組的細(xì)胞克隆形成率比照射組高(見(jiàn)圖3D)。
電鏡結(jié)果顯示,對(duì)照組線粒體成橢圓形,雙層膜及線粒體嵴較清晰(見(jiàn)圖4A);高劑量X射線照射后,U87細(xì)胞線粒體腫脹,形狀接近圓形,外膜較完整,但中央為細(xì)粒狀物質(zhì)或大空泡(見(jiàn)圖4B);但I(xiàn)WR-1-endo聯(lián)合照射組在經(jīng)過(guò)X射線照射后,部分線粒體形狀較正常,只有少量腫脹呈圓形,中央為細(xì)粒狀物質(zhì)或大空泡(見(jiàn)圖4C)。經(jīng)X射線照射的細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹嚴(yán)重,嵴幾乎完全消失(見(jiàn)圖4B);而經(jīng)X射線照射的IWR-1-endo聯(lián)合照射組中,細(xì)胞內(nèi)線粒體形狀較為完好(見(jiàn)圖4C)。提示IWR-1-endo可能通過(guò)抑制β-catenin的表達(dá),起到保護(hù)細(xì)胞線粒體的作用。
圖3 各組細(xì)胞增殖、克隆形成率比較(±s)
圖4 3組透射電鏡圖
射線對(duì)細(xì)胞的直接影響來(lái)源于輻射能量干擾細(xì)胞的氧化防御體統(tǒng),細(xì)胞中活性氧增多,最終導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷[7]。然而,細(xì)胞會(huì)通過(guò)改變基因表達(dá)、改變細(xì)胞因子表達(dá)量等方式對(duì)輻射產(chǎn)生抗性[8-11]。在本研究中,受到高劑量X射線照射的U87細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)量降低,提示細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)變化可能與輻射有一定關(guān)系。β-catenin是具有多種功能的蛋白,在細(xì)胞黏附和基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用,并且在β-catenin在有絲分裂過(guò)程中參與促進(jìn)中心體分離[12]。細(xì)胞中β-catenin的累積受有糖原合成酶激酶3β、Axin蛋白參與的多種蛋白組成的破壞復(fù)合體的影響,被破壞復(fù)合體磷酸化β-catenin進(jìn)一步被蛋白酶體水解[13]。因此穩(wěn)定破壞復(fù)合體或誘導(dǎo)其組成蛋白,可以促進(jìn)β-catenin的磷酸化和降解,從而減少細(xì)胞中β-catenin的累積。為了驗(yàn)證此推論,筆者選取IWR-1-endo來(lái)抑制細(xì)胞中β-catenin。IWR-1-endo是一種Axin蛋白激活劑,可以降低細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)量。隨著β-catenin的降低,受輻射的細(xì)胞表現(xiàn)出輻射抵抗的現(xiàn)象,如細(xì)胞增殖和克隆形成率增高等。CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)可以靈敏、快速檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量變化;而細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)可以反應(yīng)細(xì)胞貼壁后的存活率及增殖活力,反應(yīng)了細(xì)胞群體依賴性和增殖2個(gè)重要性狀,用于評(píng)估輻射對(duì)細(xì)胞的亞致死性損傷情況。結(jié)果顯示,在未經(jīng)輻射照射前,IWR-1-endo可以抑制細(xì)胞增殖和克隆形成率,說(shuō)明此條件下β-catenin表達(dá)降低,對(duì)U87增殖和存活能力起到抑制作用。但經(jīng)IWR-1-endo處理的細(xì)胞在接受輻射后,增殖細(xì)胞數(shù)和平板克隆形成率呈增加的趨勢(shì)。以上結(jié)果顯示,β-catenin表達(dá)降低對(duì)細(xì)胞抵抗輻射傷害可能有保護(hù)作用。透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn),β-catenin表達(dá)降低的細(xì)胞在接受輻射后,線粒體結(jié)構(gòu)較對(duì)照組相對(duì)完整,線粒體形態(tài)較正常。提示β-catenin表達(dá)降低可能通過(guò)保護(hù)線粒體來(lái)抵抗輻射引起的細(xì)胞凋亡,從而起到保護(hù)作用。以往研究發(fā)現(xiàn),電離輻射引起內(nèi)源性自由基增多,其作用位點(diǎn)主要為線粒體膜、DNA及蛋白質(zhì),對(duì)線粒體轉(zhuǎn)膜功能、mtDNA的斷裂和堿基突變、ATP合成等都有直接影響,因此線粒體是電離輻射誘導(dǎo)的凋亡的主要靶點(diǎn)[14-15]。線粒體形態(tài)與細(xì)胞凋亡有密切聯(lián)系,線粒體從管狀向點(diǎn)狀表型的轉(zhuǎn)換是細(xì)胞凋亡的表現(xiàn),線粒體嵴重塑和開(kāi)放與細(xì)胞色素C介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)[16]。綜上所述,β-catenin表達(dá)量的降低能維持輻射后細(xì)胞中線粒體形態(tài),這個(gè)作用可能與細(xì)胞對(duì)輻射損傷的抵抗有關(guān)。