韋瑋，陳心秋

（1.廣西省柳州市工人醫(yī)院 婦產(chǎn)科，廣西 柳州 545005；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，廣西 南寧 530021）

宮頸癌在女性生殖器官類癌癥中占首位，宮頸癌的治愈率低，死亡率高，發(fā)病率呈年輕化[1-3]。樹突狀細胞（dendritic cells,DC）-細胞因子激活的殺傷細胞（cytokine induced killer,CIK）混合生物免疫療法作為腫瘤生物治療中最成熟、應(yīng)用最廣的治療方法，能激活患者自身的免疫系統(tǒng)辨別和殺傷腫瘤細胞，可改善患者的生活質(zhì)量，延長生存期[4-6]。本文從分子機制探討DC-CIK細胞對宮頸癌細胞（Hela）殺傷及凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1　主要試劑

肝素鈉（美國Sigma公司），標準胎牛血清（美國 Gibco公司），1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司），二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide,DMSO）（美國Sigma公司），CCK-8、RNA 提 取試劑盒及RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司），Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒，粒細胞巨噬細胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）、干擾素-γ（Interferonγ,IFN-γ）、白介素-2（Interleukin-2,IL-2）、白介素-1α（Interleukin-1α,IL-1α）、白介素-4（Interleukin-4,IL-4）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）及CD3單克隆抗體（北京同立海源公司），CD8-PE、CD40-FITC、CD3-PITC、CD8-PerCP及CD56-PE抗體（美國Abcam公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、Bcl-2、Bax及 c-myc引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2　方法

1.2.1Hela細胞的培養(yǎng)Hela細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫，于10%胎牛血清和1%抗生素的1640培養(yǎng)基，37℃、5%二氧化碳CO2、95%相對濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2CIK細胞的培養(yǎng)選取2015年9月于廣西省柳州市工人醫(yī)院婦科、腫瘤科未做任何治療的宮頸癌患者58例。每位患者取靜脈血80 ml，加肝素鈉200μl。取50 ml淋巴細胞分離液，分裝10支離心管，每管加8 ml血液，3 000 r/min離心20 min。離心后吸每管上層血清至50 ml離心管，吸取中間層細胞至另一個50 ml離心管中，補加生理鹽水至50 ml，計數(shù)并離心（5 000 r/min離心5 min）。取5×107個細胞用于DC細胞的培養(yǎng)，剩余細胞用于CIK細胞的培養(yǎng)，計作第0天，加入IFN-γ（1 000 u/ml）、腺嘌呤核苷三磷酸和20%自體血清。第1天補加IL-2（300 u/ml）、IL-1α（100 u/ml）及CD3單克隆抗體（50 ng/ml），之后根據(jù)細胞的數(shù)量補加培養(yǎng)基進行擴增。第7天與DC細胞共培養(yǎng)。

1.2.3DC細胞的培養(yǎng)DC細胞的鋪板密度為5×107個/ml，鋪6孔板，2 ml/孔，計作第0天，加入 GM-CSF（1 000 u/ml）和 IL-4（500 u/ml），第 3 天補加DC培養(yǎng)液2 ml，第5天加入抗原，第6天加入TNF-α（500 u/ml）。

1.2.4DC-CIK細胞的培養(yǎng)第8天用巴氏管收集鋪板密度1×107個/ml的DC細胞與1×109數(shù)量級的CIK細胞混合共培養(yǎng)，據(jù)細胞的數(shù)量補加培養(yǎng)基進行擴增，培養(yǎng)的DC-CIK于第10天做微生物檢測，培養(yǎng)第14天用于實驗。

1.2.5DC細胞表型檢測收集5×106個/ml的DC細胞，懸于5 ml磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline,PBS），1 000 r/min離心10 min，洗去血清，以PBS調(diào)濃度至1×106個/ml，1.5 EP管分裝，分別加入20μl CD8-PE、CD40-FITC，均為鼠抗人單抗，以相應(yīng)同型抗體為對照，4℃標記30 min，3 ml PBS 1 000 r/min離心10 min，沖洗2次，最后以PBS重懸調(diào)濃度至1×106個/ml，用流式細胞儀（FACSria，美國BD公司）檢測。

1.2.6CIK細胞表型檢測收集鋪板密度5×106個/ml的CIK細胞，懸于5 ml PBS，1 000 r/min離心10 min，洗去血清，以PBS調(diào)濃度至1×106個/ml，1.5 EP管分裝，分別加入20μl CD3-PITC、CD8-PerCP及CD56-PE一抗，4℃孵育30 min后，PBS洗滌細胞，1 000 r/min離心10 min，沖洗2次，用PBS重懸細胞調(diào)濃度至1×106個/ml，用流式細胞儀檢測。

1.2.7CCK-8選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期Hela細胞，胰酶消化細胞后，接種于96孔板，接種細胞濃度為5×104個/（100μl·孔），將96孔板放入37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，細胞貼壁培養(yǎng)過夜。分別將100μl 1640完全培養(yǎng)基、培養(yǎng)至第5天的 DC 細胞 [l×105個 /（100μl·孔）]、第 7天的CIK細胞[l×105個/（100μl·孔）]和聯(lián)合培養(yǎng)生長 3 d的 CIK-DC 細胞 [l×105個 /（100 ul·孔）]接種于鋪有靶細胞的96孔板，即實驗分組為Hela組、Hela+DC組、Hela+CIK組及Hela+CIK-DC組。培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，拿出孔板加入CCK-8試劑20μl/孔，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標儀（SpectraMax M4,美國Molecular Devices公司）在450 nm處檢測每孔光密度（optical delnsity，OD）值，取3個平行復(fù)孔的平均值。

1.2.8逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）按照 RNA 提取試劑盒說明書提取Hela細胞、CIK細胞和DC-CIK共培養(yǎng)24 h Hela細胞的RNA，并檢測RNA含量。樣品OD260/OD280比值在1.8～2.0，純度較好。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 ：2×TS Reaction Mix（10μl），TransScript RT/RI Enzyme Mix（1μl），Anchored Oligo（dT）18（1μl），Total RNA（500μg），RNase-free Water to 20μl（美國賽默飛世爾科技公司）。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30個循環(huán)后，72℃再延伸1 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測目的RNA表達。采用凝膠成像系統(tǒng)（SA-1000，美國Alpha Innotech公司）進行拍照并分析。GAPDH上游引物：5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，下游引物：5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3；c-myc上 游引物：5-CAGGACTGTATGTGGAGCGGTTTC-3，下游引 物：5-TGCTGTCGTTGAGCGGGTAG-3；Bax上 游引物：5-GTGCACCAAGGTGCCGGAAC-3，下游引物：5-TCAGCCCATCTTCTTCCAGA-3；Bcl-2上游引物：5-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3，下游引物：5-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3。

1.2.9Annexin V/PI雙染取處于對數(shù)生長期的Hela細胞，消化重懸細胞后接種于6孔板中，按5×104個/ml的密度培養(yǎng)于2 ml 1640培養(yǎng)液中。待細胞貼壁后加入培養(yǎng)的DC-CIK細胞1×106個培養(yǎng)24 h。倒掉懸浮的DC-CIK細胞，胰蛋白酶適宜時間消化細胞后加入1640培養(yǎng)液（10% PBS）終止消化并離心收集細胞。用PBS洗滌細胞反復(fù)離心（2 000 r/min離心5 min）2次，離心后重懸細胞計數(shù)，實驗需5×105個細胞。每管按順序依次加入500μl的Binding Buffer，5μl Annexin V-FITC 和 5μl PI渦旋混勻后。室溫下避光反應(yīng)15 min。用流式細胞儀檢測。

1.3　統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.O統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例表示，組間比較用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用t檢驗或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　DC、CIK細胞的形態(tài)學(xué)觀察

外周血中分離出的單個核細胞貼壁2 h，細胞呈圓形并貼壁，加入IL-4和GM-CSF后細胞形態(tài)不規(guī)則，懸浮細胞增多，細胞表面有毛刺樣突起生成，且細胞體積變大后開始懸浮生長，分布均勻，具有典型的樹突狀突起。顯微鏡下可見單個核細胞在細胞因子的刺激下，細胞體積開始增加，細胞核逐漸變大，培養(yǎng)至第5天的CIK細胞集落開始聚集生長，后逐漸成簇狀克隆生長。見圖1。

2.2　DC細胞的CD8、CD40的陽性表達

流式細胞儀檢測DC細胞第0和7天時的細胞表面分子CD8和CD40，第0天時CD8的陽性表達率為1.59%，CD40的陽性表達率為2.54%。相對于第0天，第7天時CD8的陽性表達率為21.62%，CD40的陽性表達率為76.67%。第0與7天的CD8與CD40陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=19.555和11.833，均P=0.000），第7天時CD8和CD40的陽性表達率升高。見圖2。

2.3　CIK細胞的CD3、CD8及CD58的陽性表達

流式細胞儀檢測CIK細胞第0和14天時的細胞表面分子CD3、CD8及CD56，第0天時CD3的陽性表達率為37.06%，CD8的陽性表達率為26.36%，CD56的陽性表達率為14.29%。第14天時CD3的陽性表達率為86.85%，CD8的陽性表達率為82.69%，CD56的陽性表達率為47.65%。第0與14天的CD3、CD8及CD56陽性表達率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=52.113、63.985和 26.028，均P=0.000），第14天時CIK細胞的細胞表面分子CD3、CD8和CD56陽性表達率升高。見圖3。

2.4　DC-CIK細胞對Hela細胞存活率的影響

Hela組、Hela+DC組、Hela+CIK組、Hela+DC-CIK組的細胞存活率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，經(jīng)LSD-t檢驗，Hela+DC組與Hela組細胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明DC細胞不具有腫瘤細胞殺傷能力；Hela+CIK組與Hela組細胞存活率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.504，P=0.002），Hela+CIK組比Hela組下降39.72%；Hela+DC-CIK組與Hela組細胞存活率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=34.045，P=0.001），Hela+DC-CIK組比Hela組下降58.40%。見附表和圖4。

圖1　顯微鏡下觀察DC、CIK細胞的形態(tài)（×100）

圖2　流式細胞儀檢測DC細胞表面分子CD8和CD40的表達

2.5　DC-CIK細胞對Hela細胞凋亡的影響

Hela組凋亡率為（5.9±3.8）%，與Hela組相比，Hela+DC-CIK組凋亡增加了4.12倍，其凋亡率為（22.0±3.8）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.851，P=0.001）。見附表和圖5。

2.6　DC-CIK細胞對Hela細胞Bax/Bcl-2 mRNA比值的影響

Hela組、Hela+DC組、Hela+CIK組、Hela+DCCIK組的Bax/Bcl-2 mRNA比值比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，經(jīng)LSD-t檢驗，Hela+DC-CIK組與Hela組的Bax/Bcl-2 mRNA比值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.314，P=0.010）。Hela+DC-CIK 組為 Hela組的（3.49±0.08）倍。見附表和圖6。

2.7　DC-CIK細胞對Hela細胞c-myc mRNA表達水平的影響

Hela組、Hela+DC組、Hela+CIK組、Hela+DCCIK組的c-myc mRNA水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Hela+CIK組、Hela+DCCIK組與Hela組相比c-myc mRNA表達升高，但Hela+DC-CIK組升高更明顯。Hela+DC-CIK組與Hela組c-myc mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.079，P=0.000），Hela+DC-CIK組增加了60.72%。見附表和圖7。

圖3　CIK細胞表面分子CD3、CD8和CD56的表達

附表　4組細胞各試驗指標比較

圖4　DC-CIK細胞對Hela細胞存活率的影響

圖5　DC-CIK細胞對Hela細胞凋亡的影響

圖6　DC-CIK細胞對Hela細胞Bax/Bcl-2 mRNA比值的影響

圖7　DC-CIK細胞對Hela細胞c-myc mRNA表達水平的影響

3　討論

DC細胞是機體內(nèi)具有提呈抗原作用的細胞，成熟的DC細胞表面具有豐富的抗原呈遞分子，DC細胞具有激活T淋巴細胞免疫應(yīng)答和抵制腫瘤細胞免疫逃逸機制的作用。CIK細胞分泌的抗體與腫瘤細胞表面分子結(jié)合，具有較強的殺傷腫瘤細胞的能力，同時具有自然殺傷細胞的非主要組織相容性復(fù)合體限制性殺瘤優(yōu)點和T淋巴細胞強大的抗瘤活性，CIK細胞在體外經(jīng)因子誘導(dǎo)，擴大培養(yǎng)后回輸?shù)桨┌Y患者體內(nèi)，顯著提高其免疫活性，也明顯增強其抗腫瘤效果。DC細胞和CIK細胞分別通過不同因子的誘導(dǎo)后共培養(yǎng)，獲得的DC-CIK細胞兼顧DC細胞的抗原遞呈能力和CIK細胞殺瘤能力，發(fā)揮高效的抗腫瘤作用。

目前，DC-CIK細胞在其他癌癥的治療中已經(jīng)取得較滿意的效果。DC細胞與CIK細胞共培養(yǎng)后可有效抑制裸鼠肺腺癌移植瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶及Bcl-2的表達，從而抑制裸鼠肺腺癌移植瘤的生長[7]。DC-CIK免疫細胞治療可以提高固體癌的化療療效以及降低其副作用。在非小細胞肺癌的治療中，與單純化療相比，DC-CIK聯(lián)合化療治療晚期非小細胞肺癌不僅安全有效還可以提高緩解率，延長生存期，改善患者的生活質(zhì)量[8]。臨床上DC-CIK對惡性黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、腸癌及食管癌患者有較好的臨床療效，并能有效增強患者的免疫功能，改善患者的生活質(zhì)量，提高生存期[9-12]。因此，本研究通過生物學(xué)實驗探討DC-CIK細胞對宮頸癌細胞Hela存活率及凋亡的影響，為臨床上DC-CIK細胞治療宮頸癌提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，DC-CIK細胞與Hela細胞共培養(yǎng)后，Hela細胞的存活率下降，經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測后DC-CIK共培養(yǎng)的Hela細胞凋亡和壞死細胞百分比增加。研究表明乳腺癌干細胞抗原負載的DC與CIK細胞作用后誘乳腺癌細胞凋亡，其發(fā)生機制與Bcl-2蛋白超家族蛋白表達有關(guān)[13]。因此本文進一步檢測了DC-CIK細胞與Hela細胞共培養(yǎng)后Hela細胞促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的變化，結(jié)果表明Bax蛋白的mRNA水平升高，而Bcl-2蛋白的mRNA水平降低。c-myc基因是一種可異位基因，也是一種可調(diào)節(jié)基因。c-myc基因作為癌基因具有雙重作用，不僅參與細胞增殖還參與細胞凋亡，c-myc基因與正調(diào)節(jié)的生長因子協(xié)同促進細胞增殖，而與具有負調(diào)控的生長抑制基因如Fas、Fasl及Bas結(jié)合后可加速細胞凋亡，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[14]。宮頸癌細胞中c-myc基因高表達，因此本文進一步檢測DC-CIK細胞與Hela細胞共培養(yǎng)后Hela細胞中c-myc基因的影響，RT-PCR結(jié)果表明DC-CIK與Hela細胞共培養(yǎng)后Hela細胞內(nèi)c-myc mRNA水平增加60.72%。本研究表明DC-CIK可通過提高Hela細胞Bax/Bcl-2的比值和c-myc的表達誘導(dǎo)Hela細胞凋亡，這只是DC-CIK細胞誘導(dǎo)Hela細胞凋亡的1個機制，DC-CIK細胞也可能通過釋放其他因子來殺傷Hela細胞，或者通過其他信號通路誘導(dǎo)Hela細胞凋亡，其還有待進一步研究探索。