喬德輝　季昳馳　周翔宇　周陽　楊輝　程煉

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院甲狀腺外科，四川 瀘州 646000)

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌腫瘤，其中以甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid cancer，PTC)最為常見(>80%)。盡管95%的PTC患者治療后預后很好，但仍有部分患者預后較差[1-2]。目前診斷甲狀腺癌金標準是細針穿刺活檢(fine-needle aspiration biopsy； FNA)。然而FNA受腫瘤大小、位置和技術(shù)水平等影響，部分患者不能及時明確診斷和治療[3]。PTC中最常見的BRAF基因突變尚不能作為其獨立的結(jié)果預測因子[4]。因此，探尋PTC的早期診斷、術(shù)前風險評估和監(jiān)測復發(fā)標志物具有重要意義。

miRNAs是一類非編碼小RNA。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs與PTC發(fā)生、進展、預后等密切相關(guān)[5-6]。Borrelli等發(fā)現(xiàn)miRNAs與PTC的生長相關(guān)，可協(xié)助FNA診斷PTC[7]。Lee等發(fā)現(xiàn)miRNAs與PTC的進展及復發(fā)密切相關(guān)[8-9]。Sondermann等發(fā)現(xiàn)miR-9和miR-21可作為監(jiān)測PTC復發(fā)的標志物[10]。本研究在TCGA數(shù)據(jù)庫 (The Cancer Genome Atlas，http://cancergenome.nih.gov/)選取了可能在PTC中表達改變的miR-1301、miR-1976[11]，通過RT-qPCR檢測 miR-1301、miR-1976在癌旁正常組織、良性腫瘤組織、癌組織中的相對表達量，并分析其與PTC臨床病理特點之間的關(guān)系，探討其作為PTC診斷的生物標志物的可能性。

1　材料與方法

1.1臨床樣本選取 2015 年 8 月～ 2016 年 12 月于西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院就診并行手術(shù)治療的甲狀腺腫瘤患者共65 例，其中甲狀腺乳頭狀癌 30例，男性 11例，女性19 例；年齡 19～ 71 歲，平均(42.14 ± 14.1)歲，TNM分期及ASA復發(fā)風險分層按照ATA(美國甲狀腺協(xié)會)指南標準(2015)。良性腫瘤患者35例，年齡23～70歲，平均(40.14 ± 12.1)歲，見表1。 手術(shù)中留取離體腫瘤組織及距腫瘤>1cm非瘤組織于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有腫瘤及鄰近正常組織均由兩名病理科醫(yī)生確認。該研究經(jīng)西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準， 并取得所有患者的知情同意。

1.2試劑細胞裂解液Trizol reagent(BD公司，美國)。miRNA提取試劑盒miRNeasy Mini Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript II RT kit、實時熒光定量試劑盒miScript SYBR Green PCR kit(QIAGEN 公司,德國)。引物has-miRNA-1301 (RiboBio 公司)。實時熒光定量 PCR 儀( ABI 公司,美國)。

1.3檢測方法

1.3.1RNA提取、反轉(zhuǎn)錄取100 mg組織在液氮中研磨成粉末，加入1ml Trizol充分混合，靜置5min。分別按照miRNeasy Mini Kit、miScript II RT kit試劑盒說明書進行RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄操作。使用Nanodrop 2000 (NanoDrop, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)檢測總RNA濃度及純度(A260/A280在 1.8～2.0，RNA 濃度在 300～500 ng/μl之間)，瓊脂凝膠電泳成像檢測RNA完整性；反轉(zhuǎn)錄為cDNA后放入20℃冰箱保存。

表1　65例甲狀腺腫瘤患者的臨床病理資料(n)Table 1　Clinicopathological data of 65 patients with thyroid tumor

注：cPTC，經(jīng)典型乳頭狀瘤；Fv-PTC,濾泡性乳頭狀癌，Tg：甲狀腺球蛋白

1.3.2實時熒光定量PCR(RT-qPCR)將cDNA用無酶水稀釋11倍后，充分混勻用于熒光定量 PCR。取2μl稀釋后的cDNA,加入10μlMix，2μl miRNA-1301引物，2μul下游引物，4μl無酶水。反應步驟：95 ℃ 15 min，然后 95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。每個樣本進行3次重復，以 U6作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算相對表達量，最終結(jié)果表示為mean±SE。

1.3.3生物信息學分析通過Targetscan (http://www.targetscan.org/vert-50/)預測miR-1301靶基因，GEPIA (http://gepia.cancerpku.cn/index.html)分析TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌基因表達變化。

1.4統(tǒng)計學分析采用 SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。用K-S檢驗測試數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則使用獨立樣本t檢驗；如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則使用秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic; ROC曲線)用于分析miRNAs對腫瘤的診斷價值。ROC曲線下面積以及最佳截斷值使用MedCalc軟件分析。

2　結(jié)果

2.1總RNA質(zhì)量結(jié)果顯示，28s rRNA 和 18s rRNA 條帶清晰，28 s條帶的亮度約為 18s的兩倍，見圖1。所有樣本RNA濃度、純度以及完整性均符合實驗要求。

圖1　組織總RNA瓊脂糖漿電泳圖Figure 1　Agarose gel electrophoresis of the total RNA

2．2miR-1301、miR-1976在瘤旁正常甲狀腺組織、良性腫瘤組織和乳頭狀癌組織中的表達RT-qPCR結(jié)果顯示，與腫瘤旁正常甲狀腺組織比較，miR-1301在良性腫瘤組織、乳頭狀癌組織中表達均明顯降低(P<0.05)，且在乳頭狀癌組織中降低更為明顯(P<0.05)。miR-1976在腫瘤組織表達無明顯變化(P<0.05)，見圖2、3，提示miR-1301對甲狀腺腫瘤的良、惡性辨別具有重要意義。

圖2miR-1301在瘤旁正常組織、良性腫瘤組織和乳頭狀癌組織中的表達

Figure2miR-1301expressionlevelsinnormal,benignandPTCtissues

注：Normal：瘤旁正常組織；Benign：良性腫瘤組織；PTC：乳頭狀癌組織；與瘤旁正常組織比較，①P<0.05，②P<0.01；與良性腫瘤組織比較，③P<0.05

圖3miR-1976在瘤旁正常組織、良性腫瘤組織和乳頭狀癌組織中的表達

Figure3miR-1976expressionlevelsinnormal,benignandPTCtissues

注：Normal：瘤旁正常組織；Benign：良性腫瘤組織；PTC：乳頭狀癌組織

2．3miR-1301在PTC中表達變化與腫瘤原發(fā)灶情況(T)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(N)的相關(guān)性結(jié)果表明，miR-1301與PTC臨床病理分級T、N密切相關(guān)?！癟”“N”分級越高，miR-1301相對表達量越低(P=0.005或P=0.045)，見圖4、5。同時miR-1301的表達與腫瘤類型、ASA分級、性別、甲狀腺球蛋白(Tg)、多中心性等之間雖有差異，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示miR-1301可能為評估乳頭狀癌進展情況的潛在分子標志物。

圖4　miR-1301在不同T分級中的表達Figure 4　miR-1301 expression profiles in difference T stages注：與T1比較，①P<0.01

圖5　miR-1301在不同N分級中的表達Figure 5　miR-1301 expression profiles in difference N stage注：與No比較，①P<0.05

2.4miR-1301對PTC的診斷價值通過繪制ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，曲線下面積(AUC)分別為0.690和0.774；最佳 ΔCT截斷值分別為-12.84、-12.89；對診斷良性腫瘤組織敏感性為40%，特異性為91%；診斷癌組織的敏感性為50%，特異性為90%，見圖6，提示miR-1301可用于對甲狀腺腫瘤的輔助診斷。

圖6　miR-1301受試者工作特征曲線(ROC)Figure 6　miR-1301 receiver operating characteristic (ROC) curves注：sensitivity：敏感性；specificity：特異性

2.5miR-1301對PTC發(fā)生、進展的作用Targetscan預測發(fā)現(xiàn)，CLDN1、TRPC5為miR-1301的兩個靶基因， GEPIA分析TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫中甲狀腺癌基因表達，發(fā)現(xiàn) CLDN1、TRPC5在甲狀腺癌中表達升高，見圖7。本研究結(jié)果表明，CLDN1、TRPC5與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。由此推測，miR-1301可能通過對CLDN1、TRPC5的負性調(diào)控作用，參與PTC的多個生物學過程。

圖7GEPIA分析TCGA和GTE數(shù)據(jù)庫中CLDN1和TRPC5在甲狀腺癌中表達情況

Figure7CLDN1andTRPC5expressionprofilesinthePTCfromTCGAandGTExdatabyGEPIA

注：通過GEPIA 分析TCGA 和GTEx數(shù)據(jù)庫中512例甲狀腺癌組織、337例正常組織中基因表達變化,結(jié)果顯示，紅色方框代表癌組織表達情況(①P<0.05)

3　討論

本研究通過參考相關(guān)文獻，從TCGA中選取在甲狀腺乳頭狀癌中表達可能變化的miR-1301、miR-1976，利用RT-qPCR檢測他們在PTC癌旁正常組織和良性腫瘤組織、乳頭狀癌組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-1301在良、惡性腫瘤組織中表達均明顯低于腫瘤旁正常組織，且在惡性腫瘤組織中降低更為明顯(P<0.05)，而miR-1976在腫瘤組織中表達無明顯變化(P<0.05)。臨床相關(guān)性分析表明，miRNA-1301與PTC臨床病理特點密切相關(guān)。miRNA-1301在T2-T4中降低較T1更為明顯； miRNA-1301在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N1較未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移T0降低更為明顯。預測miRNA-1301靶基因推測其在乳頭狀癌的多個生物學過程中可能通過對其靶基因CLDN1、TRPC5的負性調(diào)控，抑制PTC的發(fā)生與進展。ROC曲線結(jié)果表明，miRNA-1301對PTC具有一定診斷價值，其對乳頭狀癌的診斷效能為0.774，可作為診斷PTC的潛在分子標志物。

甲狀腺乳頭狀癌起源于甲狀腺濾泡細胞。近幾十年來，發(fā)病率明顯升高[12]。雖然大部分PTC患者經(jīng)積極治療后，遠期生存率很好，但仍有部分PTC患者早期即發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移而表現(xiàn)出較差預后[12]。目前超聲引導下FNA是診斷甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的金標準[12]。但FNA的診斷準確性受多方面限制[14]。雖然聯(lián)合腫瘤相關(guān)變異基因的檢測使FNA的診斷準確率有所提高，但仍有部分患者結(jié)節(jié)性質(zhì)不能明確。這部分患者往往不能獲得適當?shù)闹委?，心理負擔較重[9]。

miRNA在多種腫瘤中通過多種途徑參與多個生物學過程，從而調(diào)控腫瘤發(fā)生與進展[15]。He 等[16]于2005首次提出miRNAs在PTC中表達異常，通過聯(lián)合5個miRNAs成功準確診斷12對惡性腫瘤組織。此后，許多研究相繼表明，miRNAs與PTC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Qiu等[17]發(fā)現(xiàn)miR-613可通過調(diào)控SphK2抑制PTC腫瘤細胞的生長、遷移及侵襲，為PTC治療提供了新方向。Minna等[18]發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p在PTC中具有與巨噬細胞類似作用，可抑制腫瘤進展。Zhang等[19]通過分析甲狀腺癌中miRNA表達圖譜發(fā)現(xiàn)多個miRNAs在PTC組織中表達異常，且與PTC病理分期相關(guān)，提示miRNAs在PTC的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

目前研究表明，miRNA-1301表達變化與多種腫瘤相關(guān)。Krishnan 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1301可能參與了頭頸部鱗狀細胞癌的發(fā)病與進展。Bi等[21]報道m(xù)iRNA-1301可負性調(diào)控PPP2R2C，促進前列腺癌細胞增殖。Bai[22]和Zhi等[23]發(fā)現(xiàn)，miRNA-1301在膠質(zhì)瘤組織中表達降低，與膠質(zhì)瘤多樣化進展及差預后明顯相關(guān)，體外實驗證實miRNA-1301可通過負性調(diào)控N-Ras抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖。Wang等[24]研究表明，miRNA-1301通過UBE4B-p53通路對多種人腫瘤細胞的遷移及侵襲產(chǎn)生抑制作用。但miRNA-1301在PTC中表達情況尚未見報道。我們的研究結(jié)果表明，miRNA-1301在PTC癌細胞中表達降低。臨床相關(guān)性分析表明，miRNA-1301在PTC中表達與腫瘤原發(fā)灶情況“T”及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況“N”分級明顯相關(guān)?！癟”“N”分級越高，miRNA-1301表達降低更為明顯。我們還分析了miRNA-1301與腫瘤亞型、ASA分級、性別、甲狀腺球蛋白(Tg)、多中心性等的關(guān)系，但未發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學意義的差異，這可能是樣本量不夠的原因所致，將來還需進一步擴大樣本進行深入分析。miR-1976與腫瘤的關(guān)系鮮有報道。Chen等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1976在非小細胞肺癌中作為抑癌基因表達減低，并且和腫瘤TNM分期以及經(jīng)手術(shù)治療后患者生存率相關(guān)。高表達的miR-1976可通過對其靶基因PLCE1的表達抑制，從而抑制非小細胞肺癌的生長與遠處轉(zhuǎn)移。我們分別在腫瘤旁正常組織、良性腫瘤組織、乳頭狀癌組織中檢測了miR-1976的表達，遺憾的是，我們未能發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學意義的差異，這可能提示miR-1976未參加PTC發(fā)生、進展的生物學過程。我們此次樣本量有限，以后我們將進一步加大樣本量進行驗證。

ROC曲線用于評估分子標志物的診斷效能早有報道。Li等[26]通過ROC曲線分析表明，miR-25-3p及miR-451a對PTC診斷效能分別為0.835及0.857，特異性分別為68.8% 及66.7%，敏感性為92.8% 及88.9%。Kitano等[27]繪制ROC曲線表明，miR-7與miR-126對甲狀腺癌的診斷價值分別為0.806及0.767。我們繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，miRNA-1301診斷PTC癌組織的敏感性為50%，特異性為90%，AUC為0.774，提示miRNA-1301可作為分子標志物為PTC診斷提供參考。

miRNA通過與靶基因的結(jié)合發(fā)揮其生物學功能。我們通過Targetscan預測miR-1301靶基因，結(jié)合GEPIA選出在PTC中表達上調(diào)的基因CLDN1、TRPC5[28]。CLDN1是一種跨膜蛋白，與細胞間緊密連接，密切相關(guān)，參與多種腫瘤細胞的遷移與侵襲[29]。Mahati等[30]報道，CLDN1在肝癌中表達增高，可促進腫瘤細胞增殖與遷移。Huang等[31]研究發(fā)現(xiàn)，CLDN1在胃癌中可通過抑制失巢凋亡，促進腫瘤細胞的增殖與遷移。有研究報道，CLDN1在PTC中表達增高與腫瘤發(fā)生侵襲與遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[32]。TRPC5是瞬時受體電位通道5，為一種受體激活的非選擇性鈣通道。Chen等[32]報道TRPC5在結(jié)腸癌中通過調(diào)控HIF-1α/Twist通路促進腫瘤轉(zhuǎn)移。Wang等[33]發(fā)現(xiàn)，TRPC5在乳腺癌患者外周血中高表達與化療藥物耐藥相關(guān)，可作為輔助檢測患者耐藥的分子標志物，提示CLDN1、TRPC5與腫瘤的增殖、凋亡、遷移、遠處轉(zhuǎn)移和腫瘤耐藥等密切相關(guān)。由此我們推測，在PTC中miRNA-1301通過對CLDN1、TRPC5的靶向調(diào)控作用，抑制PTC的發(fā)生、發(fā)展。

4　結(jié)論

本實驗通過在TCGA數(shù)據(jù)庫中選取并通過RT-qPCR驗證發(fā)現(xiàn)，miRNA-1301在PTC癌組織中表達降低，且與PTC臨床病理“T”“N”分級密切相關(guān)，對PTC具有一定診斷價值。同時miRNA-1301可能通過對其靶基因CLDN1、TRPC5的負性調(diào)控作用，參與了甲狀腺乳頭狀癌的多個生物學過程，抑制PTC的發(fā)生與進展。miRNA-1301可作為PTC診斷、術(shù)前風險評估和預后分析的潛在分子標志物。