李 濤 周艷華 孫桂芳 楊 滔 尹偉成 楊慶懿

(1. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長沙 410111；2. 長沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004)

特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品(以下簡稱特醫(yī)嬰配食品)是指針對患有特殊紊亂、疾病或醫(yī)療狀況等特殊醫(yī)學(xué)狀況的營養(yǎng)需求而設(shè)計(jì)的粉狀或液態(tài)配方食品。針對不同的嬰兒患病類型分為6種配方，包括無乳糖或低乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解或氨基酸配方、早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方、母乳營養(yǎng)補(bǔ)充劑配方、氨基酸代謝障礙配方[1]。維生素A是一類脂溶性維生素，又稱視黃醇，其主要生理功能是維持正常視覺、增強(qiáng)機(jī)體抗感染力及維持骨骼健康[2]。維生素A在特醫(yī)嬰配食品中為必須營養(yǎng)強(qiáng)化成分，通過添加視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化[3-4]。

目前，維生素A測定主要有液相法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]?，F(xiàn)有食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中維生素A測定是將視黃醇酯類皂化為醇類進(jìn)行分析，一般需對樣品進(jìn)行酶解、皂化、提取、分離、濃縮等步驟，操作極其繁瑣耗時(shí)[7-8]。特醫(yī)嬰配食品有6種配方，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)按照現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中皂化條件進(jìn)行皂化，會出現(xiàn)皂化不完全、嚴(yán)重乳化、維生素A不能完全游離等現(xiàn)象，且脂溶性維生素不穩(wěn)定，在此分析過程中易損耗，回收率不高，不能進(jìn)行批量操作。本試驗(yàn)擬采用正相高效液相色譜法直接測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中的視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯[9]，以期能準(zhǔn)確測定產(chǎn)品中營養(yǎng)強(qiáng)化視黃醇的類別及含量，為檢測特醫(yī)嬰配食品中維生素A提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

特醫(yī)無乳糖配方奶粉(A)、特醫(yī)乳蛋白部分水解配方奶粉(B)、特醫(yī)乳蛋白深度水解配方奶粉(C1)/氨基酸配方奶粉(C2)、特醫(yī)早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方乳(D)，特醫(yī)母乳營養(yǎng)補(bǔ)充劑(E)、特醫(yī)氨基酸代謝障礙配方乳(F)：市售；

視黃醇棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.1%，德國Dr. Eherenstorfer公司；

視黃醇醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度98.5%，德國Dr. Eherenstorfer公司；

叔丁基甲醚、正己烷、異辛烷：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司；

氫醌、無水乙酸鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

木瓜蛋白酶：酶活> 400 U/mg，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：LC-20A型，帶DAD檢測器，日本島津公司；

漩渦振蕩器：HMS-350型，上海珂淮儀器有限公司；

電子分析天平：BS224S型，德國賽多利斯公司；

臺式冷凍離心機(jī)：X1R型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

pH酸度計(jì)：PB-10型，德國賽多利斯公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS-28型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 稱取視黃醇棕櫚酸酯約25 mg(精確至0.1 mg)至25 mL容量瓶中，異辛烷溶解并定容至刻度；稱取視黃醇醋酸酯約25 mg(精確至0.1 mg)至25 mL容量瓶中，無水乙醇溶解并定容至刻度。分別精取0.50 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至50 mL容量瓶中，異辛烷稀釋至刻度，得10.0 μg/mL混標(biāo)儲備液，分別精取0.050，0.10，0.20，0.50，1.0，2.0，5.0 mL 混標(biāo)儲備液至10 mL容量瓶中，異辛烷稀釋至刻度，得濃度為0.05～10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2 供試品溶液的制備

(1) 樣品稱量：固體樣品精確稱重25 g至250 mL碘量瓶中，加入200 mL純水(約40～45 ℃)，溶解并冷卻，稱重。轉(zhuǎn)移5.0 g溶解后的新樣品至50 mL離心管，計(jì)算樣品質(zhì)量(粉末當(dāng)量)；液態(tài)樣品精確稱取5.0 g至50 mL離心管中。

(2) 酶解：800 U/mL木瓜蛋白酶溶液：稱取100 mg氫醌和4.0 g無水乙酸鈉于100 mL容量瓶中，加純水80 mL溶解，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，加入0.2 g木瓜蛋白酶超聲5 min，冷卻后定容至刻度。向樣品溶液中加入5.0 mL木瓜蛋白酶溶液，混勻后置于(37±2) ℃水浴30 min后冷卻。

(3) 提?。合蛎附庖褐屑尤?0.0 mL 2%醋酸甲醇，振蕩15 min，加入10.0 mL異辛烷振蕩提取15 min，5 000 r/min離心10 min，取異辛烷層用于高效液相色譜分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax NH2(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：正己烷-25%叔丁基甲醚正己烷(體積比95∶5)，等梯度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL；紫外檢測器波長：325 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

取標(biāo)準(zhǔn)使用液注入液相色譜儀測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。視黃醇棕櫚酸酯線性方程為：Y=286 042X-662.074 5(R2=0.999 9)，視黃醇醋酸酯線性方程為Y=309 862.3X-4 460.171(R2=0.999 9)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為0.05～10.00 μg/mL，校準(zhǔn)曲線線性良好，線性低點(diǎn)是GB 5009.82—2016 中低點(diǎn)的1/4倍，測定范圍更廣。

2.2 檢出限和定量限

取空白響應(yīng)值的2～3倍對應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 μg/mL，平行測定11次，根據(jù)檢出限的計(jì)算方法LOD=3sd/b和LOQ=10sd/b(sd為標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為工作曲線斜率)，當(dāng)取樣量為0.5 g，異辛烷體積為10.0 mL時(shí)，方法檢出限和定量限見表1。此方法的檢出限與定量限是GB 5009.82—2016 的1/3，說明此檢驗(yàn)方法具有更高的靈敏度。

2.3 樣品含量測定和精密度試驗(yàn)

特醫(yī)嬰配食品A～F分別平行取樣6組，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)液相色譜測定，特醫(yī)嬰配食品A～F號中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯含量及精密度結(jié)果見表2、3。結(jié)果顯示特醫(yī)嬰配食品中通常添加一種視黃醇酯類作為維生素A來源，且添加量依據(jù)適用對象的差異而不同，各配方中視黃醇棕櫚酸酯含量為0.0～817.0 μg/100 g，精密度為0.9%～9.4%；視黃醇醋酸酯含量為0.0～8 683.0 μg/100 g，視黃醇醋酸酯精密度為3.3%～6.3%，精密度均滿足測定要求。

表1 檢出限和定量限Table 1 Detection limit and limit of quantification

表2 特醫(yī)嬰配食品中視黃醇棕櫚酸酯含量及精密度Table 2 Content and precision of retinol palmitate in formulas for special medical purposes intended for infants

表3 特醫(yī)嬰配食品中視黃醇醋酸酯含量及精密度Table 3 Content and precision of retinol acetate in formulas for special medical purposes intended for infants

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

選取深度水解配方奶粉(C1)為代表進(jìn)行特醫(yī)嬰配食品回收率試驗(yàn)，共9份，每個(gè)濃度3份，分別添加約0.5，1.0，2.0倍樣品檢測濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，低中高3個(gè)加標(biāo)濃度添加量分別為3.0，6.0，10.0 μg。按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)液相色譜儀測定。視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯加標(biāo)回收率見表4。由表4可知，視黃醇棕櫚酸酯的不同添加濃度下回收率為82.6%～90.0%，RSD值為1.8%～2.5%，視黃醇醋酸酯不同添加濃度下回收率為81.0%～88.6%，RSD值為2.2%～4.5%，深度水解配方奶粉為特醫(yī)嬰配奶粉中最復(fù)雜基質(zhì)之一，說明該方法對特醫(yī)嬰配食品中不同濃度視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯的測定具有較高的準(zhǔn)確度。

表4 樣品加標(biāo)回收率Table 4 Results of recovery for spiked samples

2.5 檢驗(yàn)方法的選擇性

視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜見圖1，7種特醫(yī)嬰配食品中視黃醇酯圖譜見圖2，檢驗(yàn)方法系統(tǒng)性評價(jià)參數(shù)結(jié)果見表5。由圖1可知，視黃醇棕櫚酸酯保留時(shí)間為3.5 min，視黃醇醋酸酯保留時(shí)間為6.0 min，樣品測定過程中2種視黃醇酯均未發(fā)生明顯漂移，該檢驗(yàn)方法能準(zhǔn)確定性。由表5可知，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品中2種視黃醇酯的分離度均>1.8，高于R≥1.5的一般要求，理論塔板數(shù)均大于8 000，高于t≥3 000的一般要求，表明該檢驗(yàn)方法將待測成分與其它雜質(zhì)進(jìn)行了基線分離，分離效能良好，說明該檢驗(yàn)方法具有良好的系統(tǒng)適用性。特醫(yī)嬰配食品成分極其復(fù)雜，但樣品基質(zhì)不會干擾視黃醇酯分離，表明該檢驗(yàn)方法對特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒食品中2種視黃醇酯具有良好選擇性，分離度高。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯Figure 1 Chromatogram of retinol palmitate and retinol acetate in standard solution

圖2 特醫(yī)嬰配食品中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯

Figure 2 Chromatogram of retinol palmitate and retinol acetate in formulas for special medical purposes intended for infants

表5 檢驗(yàn)方法系統(tǒng)性評價(jià)參數(shù)結(jié)果Table 5 Results of method systematic evaluation parameter

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了正相高效液相色譜測定特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯的方法。采用木瓜蛋白酶酶解擁有脂肪膠束涂層的親水性蛋白，釋放視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯，酸化甲醇沉淀蛋白質(zhì)，異辛烷提取，氨基柱正相分離，紫外檢測2種視黃醇酯。在0.05～10.0 μg/mL時(shí)呈線性相關(guān)(R2=0.999 9)，視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯檢出限分別為2.0，2.5 μg/100 g，不同添加濃度回收率為81.0%～90.0%，也可通過公式(維生素A=視黃醇棕櫚酸酯×0.55+視黃醇醋酸酯×0.87)換算得到特醫(yī)嬰配食品中維生素A含量，此試驗(yàn)的線性范圍和檢出限均優(yōu)于現(xiàn)有食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.82—2016。

前期試驗(yàn)研究表明現(xiàn)有國標(biāo)測定特醫(yī)嬰配食品中視黃醇時(shí)，多種配方產(chǎn)品皂化時(shí)會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象嚴(yán)重、皂化不完全和精密差等問題。本試驗(yàn)方法無需將視黃醇酯皂化為視黃醇，采用直接測定樣品中視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯，避開操作繁雜的皂化過程，流程簡單，精密度和準(zhǔn)確度高，可實(shí)現(xiàn)批量檢測。此試驗(yàn)建立的檢測方法簡單、快速、準(zhǔn)確，針對特醫(yī)嬰配產(chǎn)品中的視黃醇棕櫚酸酯和視黃醇醋酸酯檢測重復(fù)性好。此試驗(yàn)前處理酶解液還可用于測定α生育酚醋酸酯和α生育酚，后續(xù)將對此進(jìn)一步研究。