王晨亮，彭麗姿，張靚

(江西省九江市第一人民醫(yī)院病理科，九江 332000)

子宮內(nèi)膜癌作為女性生殖道常見的惡性腫瘤，近年來隨著生活環(huán)境及飲食結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)病率越來越高，普通人群中發(fā)病率為6.32/10萬[1]。而在子宮內(nèi)膜癌中，又以子宮內(nèi)膜樣腺癌為主要發(fā)病類型。其發(fā)病的主要原因是由無抵抗的高水平的雌激素不斷刺激，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)增殖，直至惡變

[2]。女性子宮內(nèi)膜本身受機(jī)體激素周期性調(diào)控，呈現(xiàn)規(guī)律的增生及脫落；當(dāng)女性內(nèi)分泌系統(tǒng)不穩(wěn)定的時(shí)候，尤其是在圍絕經(jīng)期期間，由于卵泡的衰竭，不能產(chǎn)生足夠的孕激素，與雌激素協(xié)同作用于子宮內(nèi)膜，使得子宮內(nèi)膜的持續(xù)性增生。當(dāng)細(xì)胞分裂增生的過程中，如果出現(xiàn)DNA修復(fù)功能受損，就容易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此，在臨床上，患者常伴有肥胖、多囊卵巢、月經(jīng)紊亂等癥狀；而在微觀層面則常常伴隨DNA修復(fù)功能的異常。

1　材料和方法

1.1材料 收集我院及九江市婦幼保健院2013年-2017年病理標(biāo)本66例，其中正常內(nèi)膜20例，非典型增生內(nèi)膜16例，高分化子宮內(nèi)膜樣癌13例，中分化子宮內(nèi)膜樣癌9例，低分化子宮內(nèi)膜樣癌8例。年齡34-69歲。

1.2方法 所有標(biāo)本均經(jīng)過10%的中性緩沖甲醛固定，標(biāo)準(zhǔn)取材，常規(guī)制片，HE染色；組織采用免疫組化SP三步法，檢測(cè)錯(cuò)配修復(fù)蛋白、P27及Ki67的表達(dá)情況。SP試劑盒購自北京中杉金橋試劑公司， 即用型，MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、P27、Ki67。試劑經(jīng)過校驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程按照說明書進(jìn)行，同時(shí)以組織內(nèi)非腫瘤細(xì)胞作為內(nèi)對(duì)照。

1.3結(jié)果判定 所有標(biāo)記均為細(xì)胞核著色，呈棕黃色改變，任何強(qiáng)度的著色均視為陽性，瀏覽切片的全部范圍，通過觀察腫瘤及內(nèi)對(duì)照，在試驗(yàn)結(jié)果可信的基礎(chǔ)上，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。錯(cuò)配修復(fù)蛋白(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6) 的判定， 以 MLH1 或MSH2的表達(dá)缺失、合并或者不合并PMS2及MSH6的缺失，視為MMR缺陷[3]；而P27和Ki67估算陽性細(xì)胞所占所有腫瘤細(xì)胞的百分比，按10%遞進(jìn)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0作為統(tǒng)計(jì)分析軟件，運(yùn)用方差分析和Fisher檢驗(yàn)，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1P27表達(dá)結(jié)果 運(yùn)用方差分析，F(xiàn)值=3.387，P=0.014，P27的表達(dá)在不同分組之間存在差異；組內(nèi)兩兩比較，中分化腺癌和高分化腺癌分別與正常組和非典型增生都存在差異，P＜0.05。

2.2Ki-67表達(dá)結(jié)果 運(yùn)用卡方檢驗(yàn)，P=0.030，Ki67的表達(dá)在各組之間存在差異；組內(nèi)兩兩比較，中分化腺癌、高分化腺癌和低分化腺癌分別與正常組和非典型增生都存在差異，P＜0.05。

2.3錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)結(jié)果 運(yùn)用Fisher精確檢驗(yàn)，P=0.168，錯(cuò)配修復(fù)蛋白（MMR）在各組間分布無差異。本次試驗(yàn)中大部分標(biāo)本染色均呈現(xiàn)陽性染色無論分化程度；因錯(cuò)配修復(fù)蛋白在正常組織中呈現(xiàn)陽性著色，MMR缺失組織則呈陰性染色，染色模式呈現(xiàn)“全”或“無”的形態(tài)，而本次實(shí)驗(yàn)的病例主要以MLH1和PMS2缺失為主，而且在低分化腺癌中比例略高。

表1　P27和Ki67的表達(dá)

表2　錯(cuò)配修復(fù)蛋白的表達(dá)

3　討論

隨著分子病理的發(fā)展，近些年來，錯(cuò)配修復(fù)蛋白作為腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，越發(fā)受到重視；甚至在腫瘤化療的敏感性方面也具有指導(dǎo)意義[4]。錯(cuò)配修復(fù)蛋白是一組由錯(cuò)配修復(fù)基因編碼的蛋白質(zhì)，在人類機(jī)體中主要由MLH1、MLH3、PMS1、PMS2、MSH2、MSH3、MSH4、MSH5、MSH6這九種蛋白質(zhì)來執(zhí)行功能。其中以MLH1、PMS2。MSH2、MSH6最為重要，他們可兩兩結(jié)合形成二聚體對(duì)DNA序列中的復(fù)制錯(cuò)誤，進(jìn)行糾正。而錯(cuò)配修復(fù)基因的胚系突變則是引起Lych綜合征的根本原因[5]。同時(shí)，MLH1的甲基化則是引起散發(fā)性結(jié)直腸癌的重要原因。因此，錯(cuò)配修復(fù)基因的檢測(cè)對(duì)腫瘤患者的治療及預(yù)后具有重要意義。大量的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)顯示，用免疫組化（IHC）的方法進(jìn)行錯(cuò)配修復(fù)蛋白的檢測(cè)，簡(jiǎn)單易行，成本較低，而且與基因檢測(cè)對(duì)比具有較高的符合率[6]。

P27全稱為周期素依賴的蛋白酶抑制蛋白，由P27基因編碼，定位于12p13，包括2個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，編碼198個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑CIP/KIP蛋白家族成員之一[7]。P27具有多種生物學(xué)功能，能廣泛抑制各種細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期依賴性激酶CDK的活性，從而抑制細(xì)胞增殖。作用途徑為通過與CDK或細(xì)胞周期素復(fù)合物cyclinD-CDK結(jié)合，抑制CyclinE-CDK2和CyclinD-CDK4等G1期激酶復(fù)合物，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，控制細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)控，具有抑制細(xì)胞增生的作用。從而使細(xì)胞有機(jī)會(huì)修復(fù)損傷的DNA或DNA復(fù)制產(chǎn)生的錯(cuò)誤。P27蛋白的過度表達(dá)使細(xì)胞停滯于G1期，P27蛋白低表達(dá)或缺失可使細(xì)胞增殖失控，增殖與凋亡失衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[8]。

Ki-67是一種表達(dá)于增殖細(xì)胞的核抗原，位于人第10號(hào)染色體，其具體功能尚不清楚，但Ki-67抗原主要表達(dá)于細(xì)胞增殖周期的G1、S(DNA合成期)、G2期和M期，而在G0期不表達(dá)。由于其半衰期短，可以準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的增殖活性[9]。Ki-67作為標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的抗原，在G1期和S期表達(dá)較低，在M期表達(dá)較高，近年已廣泛用于研究腫瘤的生物學(xué)行為，判斷腫瘤的危害性，是最具前途的細(xì)胞增殖標(biāo)記。有研究表明，它與很多惡性腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后具有相關(guān)性。

通過本次研究發(fā)現(xiàn)，P27與Ki67之間存在負(fù)相關(guān)，但是，又不是完全的對(duì)應(yīng)關(guān)系，以此印證了除P27以外，細(xì)胞周期還受到其他諸多因素的影響[10]。本研究主要旨在探究子宮內(nèi)膜癌中P27對(duì)細(xì)胞周期的影響。在結(jié)果判定中，顯示出幾個(gè)有趣的現(xiàn)象：⑴在同一患者的標(biāo)本中，正常組織及不同腫瘤區(qū)域中，P27與Ki67均表現(xiàn)出不一樣的著色強(qiáng)度和陽性比例，說明在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中，P27和Ki67均呈現(xiàn)出不一樣的表達(dá)狀態(tài)，又因?yàn)镵i67的表達(dá)只是腫瘤的所處周期的一個(gè)表現(xiàn)，因而P27的表達(dá)才顯得意義特別，值得探究；⑵在同一組織的相同區(qū)域，P27與Ki67的變化也是存在對(duì)應(yīng)關(guān)系，說明Ki67的變化至少一部分是由于P27的改變所導(dǎo)致，因此P27的狀態(tài)也同樣可以用來判斷腫瘤的預(yù)后情況分析；⑶因?yàn)槟[瘤異質(zhì)性的問題，對(duì)于全片的P27及Ki67的表達(dá)，似乎并不合適用一個(gè)總的數(shù)據(jù)來概括。因此既往工作中，對(duì)腫瘤標(biāo)記的定性結(jié)論，存在一定的局限性，因?yàn)?，傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)方法是尋找到一個(gè)陽性比例最高的區(qū)域，進(jìn)行計(jì)數(shù)，盡管有時(shí)這樣的區(qū)域在全片中所占比例相當(dāng)?shù)?；這就導(dǎo)致對(duì)腫瘤的平均增殖狀態(tài)呈現(xiàn)一個(gè)過高的估計(jì)。因此，對(duì)不同的病例，不同區(qū)域，用一個(gè)描述性結(jié)論進(jìn)行分析，似乎更有利于對(duì)腫瘤預(yù)后的估計(jì)。另外，在本次樣本中，因錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺陷的患者數(shù)量并不如想象中的那么多，這也與其他研究者的數(shù)據(jù)相似[11]，這也導(dǎo)致了，盡管在不同分組間的分布呈現(xiàn)明顯的區(qū)別，但是并不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在一些病例中，在正常組織中和腫瘤組織中，錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)的水平呈現(xiàn)出不一致的狀況。這可能是由于錯(cuò)配修復(fù)基因甲基化的狀態(tài)不一造成[12]；也可能是RNA表達(dá)水平不足導(dǎo)致。因此，MMR的表達(dá)變化，可能也屬于腫瘤改變的中間環(huán)節(jié)，因?yàn)殄e(cuò)配修復(fù)蛋白的功能影響是廣譜的，在涉及腫瘤增生的各個(gè)環(huán)節(jié)中的相關(guān)基因可能都會(huì)在在影響之列，也就導(dǎo)致了更多的染色體不穩(wěn)定和突變的積累。