王 琰，劉金蘭

(天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院/天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

魚病的發(fā)生是宿主、病原和環(huán)境三者相互作用的結(jié)果。環(huán)境脅迫可以分為急性脅迫和慢性脅迫，指的是魚類所處的生存環(huán)境產(chǎn)生急劇變化而對(duì)其產(chǎn)生刺激，從而能打破魚類正常的生理功能，對(duì)其健康造成不利影響[9]。在魚類養(yǎng)殖過程中，溫度、pH值、亞硝酸鹽濃度等是影響魚體正常生長的重要脅迫因子。由于魚類是水生變溫動(dòng)物，它的生長發(fā)育與水環(huán)境溫度密切相關(guān)。溫度不僅直接影響正常的生長發(fā)育與魚體生理功能，而且間接制約了水體中氨氮和溶解氧等理化因子的含量[10]。pH值作為不可忽視的脅迫因子之一，過高或過低都會(huì)對(duì)魚體產(chǎn)生影響[11]。亞硝酸鹽濃度過高可以降低魚體血液載氧能力，造成組織缺氧，甚至導(dǎo)致窒息死亡[12-14]。

研究蠟樣芽孢桿菌大多集中在食品領(lǐng)域，在水產(chǎn)上相對(duì)較少，關(guān)于其毒力基因表達(dá)的研究非常缺乏。開展環(huán)境脅迫因子對(duì)細(xì)菌毒力基因表達(dá)的研究，將有助于闡明細(xì)菌的流行病規(guī)律、蠟樣芽孢桿菌感染的發(fā)生機(jī)理，以及提供有效的生態(tài)學(xué)防治措施。本試驗(yàn)將研究溫度、pH值和亞硝酸鹽濃度這3種常見環(huán)境脅迫因子的變化對(duì)蠟樣芽孢桿菌5種毒力基因表達(dá)的影響，同時(shí)運(yùn)用正交試驗(yàn)研究其對(duì)斑馬魚致病性的影響，以期能明確養(yǎng)殖條件變化對(duì)蠟樣芽孢桿菌致病性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用Bc分離自有典型臨床出血癥狀的半滑舌鰨，經(jīng)檢驗(yàn)含溶血素 BL基因(hblC)、腸毒素 T 基因(bceT)、細(xì)胞毒素 K 基因(CytK)、多效調(diào)控因子(plcR)、非溶血性腸毒素(nheA)，由天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物病害實(shí)驗(yàn)室保種。斑馬魚購自天津市中環(huán)花鳥魚蟲市場(chǎng)，長度為3.0～3.5 cm，均健康無病，經(jīng)過1周暫養(yǎng)，待試驗(yàn)魚穩(wěn)定后，用于試驗(yàn)。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 單因素培養(yǎng)基 (1)溫度組(T)。將2216E海水液體培養(yǎng)基調(diào)pH值為7.2，不加亞硝酸鹽。(2)pH值組(P)。將2216E海水液體培養(yǎng)基pH值分別調(diào)為6.0、7.2 、8.5，不加亞硝酸鹽。(3)亞硝酸鹽濃度組(Y)。在pH值為7.2的2216E海水液體培養(yǎng)基中加入亞硝酸鹽使其濃度為0.75、1.50、3.00 mg/L。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)3因素(溫度、pH值、亞硝酸鹽濃度)3水平，因素與水平見表1。在基礎(chǔ)2216E海水液體培養(yǎng)基中按照表2方案進(jìn)行配制。

表1 環(huán)境脅迫因子正交試驗(yàn)因素水平

表2 環(huán)境脅迫因子正交試驗(yàn)方案

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 在3組(每組3個(gè)重復(fù))單因素培養(yǎng)基中，分別加入100 μL保存在-20 ℃的Bc菌株。T組分別在25、30、35 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)12 h；P組和Y組在30 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)12 h。

在配制好的9組正交試驗(yàn)培養(yǎng)基中，分別加入100 μL保存在-20 ℃的Bc菌株。按照表2的設(shè)計(jì)，分別在對(duì)應(yīng)溫度的搖床180 r/min培養(yǎng)12 h。

1.3.2 RNA的制備和反轉(zhuǎn)錄 將經(jīng)過“1.3.1”節(jié)方法培養(yǎng)的細(xì)菌菌液1.0 mL，放入1.5 mL無核酸酶的離心管中離心留沉淀及100 μL上清，充分振蕩懸浮細(xì)菌，直至沒有細(xì)胞團(tuán)塊。然后按照飛捷(RNAfast200)RNA提取說明書步驟進(jìn)行RNA提取。對(duì)提取的RNA樣品均進(jìn)行凝膠電泳成像檢測(cè)，檢驗(yàn)提取的RNA中無基因組DNA污染。

將提取的RNA測(cè)濃度之后，按照TIANScript RT Kit試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR擴(kuò)增所用引物參照表3。PCR反應(yīng)體系(20 μL)包括：2×TaqPCR Mix(天根)10 μL，25 μmol的引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用滅菌超純水調(diào)整終體積至20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

表3 Bc毒力基因引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.3.3 Bc 致病性試驗(yàn) 根據(jù)表2的正交試驗(yàn)方案，進(jìn)行正交試驗(yàn)。調(diào)試好試驗(yàn)水體各項(xiàng)指標(biāo)后，在2216E海水液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)試最終濃度為108CFU/mL的Bc對(duì)魚體進(jìn)行養(yǎng)殖功毒試驗(yàn)。根據(jù)7 d內(nèi)試驗(yàn)魚體死亡情況，記錄其死亡率(%)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響

2.1.1 溫度對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響 從表4和圖1至圖5可以看出，在溫度梯度下，CytK和plcR差異不顯著，其中CytK和plcR35 ℃時(shí)基因表達(dá)較強(qiáng)；becT在溫度為25 ℃時(shí)基因表達(dá)顯著高于30、35 ℃，30、35 ℃間差異不明顯；nheA在溫度為30、35 ℃時(shí)基因表達(dá)顯著高于25 ℃，但30 ℃的基因表達(dá)與35 ℃時(shí)差異不顯著；hblC在溫度為25、35 ℃時(shí)基因表達(dá)顯著高于30 ℃，而25、35 ℃基因表達(dá)間差異不顯著。

2.1.2 pH值對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響 從表5和圖1至圖5可以看出，在pH值梯度下，CytK和nheA基因表達(dá)均差異不顯著，其中CytK在pH值為8.5時(shí)基因表達(dá)較強(qiáng)，nheA

表4 不同溫度值對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表5、表6同。

在pH值為7.2時(shí)基因表達(dá)較強(qiáng)；becT、hblC和plcR均在pH值為8.5時(shí)基因表達(dá)顯著高于pH值為7.2和6.0，而pH值為7.2、6.0間基因表達(dá)差異不顯著。

2.1.3 亞硝酸鹽濃度對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響 從表6和圖1至圖5可以看出，CytK在亞硝酸鹽濃度為3.00 mg/L時(shí)的基因表達(dá)顯著高于0.75、1.50 mg/L，而濃度為0.75、1.50 mg/L 間差異不顯著；hblC、nheA均在濃度為1.50、3.00 mg/L 時(shí)基因表達(dá)顯著高于0.75 mg/L時(shí)，并且均在 3.00 mg/L 時(shí)基因表達(dá)略高于1.50 mg/L時(shí)；becT和plcR均在濃度3.00 mg/L時(shí)基因表達(dá)顯著高于濃度為1.50、0.75 mg/L 時(shí)。

2.2 正交試驗(yàn)對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響

影響CytK基因表達(dá)的因素依次為亞硝酸鹽濃度>溫度>pH值，三者之間均無顯著差異(表8)，基因表達(dá)最高組是第4組，即溫度25 ℃、pH值8.5、亞硝酸鹽濃度1.50 mg/L(表7)；影響becT基因表達(dá)的因素依次為溫度>亞硝酸鹽濃度>pH值，三者之間差異不顯著(表9)，基因表達(dá)最高組是第1組，即溫度35 ℃、pH值8.5、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L(表7)；影響hblC基因表達(dá)的因素依次為溫度>pH值>亞硝酸鹽濃度，三者間差異不顯著，基因表達(dá)最高組是第9組，即溫度25 ℃、pH值6.0、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L(表7)；影響plcR基因表達(dá)的因素依次為溫度>亞硝酸鹽濃度>pH值，三者間差異不顯著(表11)，基因表達(dá)最高組是第9組，即溫度25 ℃、pH值6.0、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L(表7)；影響nheA基因表達(dá)的因素依次為溫度>亞硝酸鹽濃度>pH值，三者間差異不顯著(表12)，基因表達(dá)最高組是第9組，即溫度25 ℃、pH值6.0、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L(表7)。第1組至第9組Bc毒力基因表達(dá)結(jié)果見圖6至圖14。

2.3 環(huán)境脅迫因子對(duì)Bc致病性的影響

影響B(tài)c致死率的因素為溫度>亞硝酸鹽濃度>pH值，三者之間無顯著差異，其致死率最高組為第9組，即溫度 25 ℃、pH值6.0、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L(表13、表14)。

3 討論與結(jié)論

3.1 單因素對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響

表5 不同pH值對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響

表6 不同亞硝酸鹽值對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響

表7 Bc毒力基因表達(dá)正交試驗(yàn)結(jié)果

表8 CytK正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表9 becT正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表10 hblC正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表11 plcR正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表12 nheA正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

為明確環(huán)境對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響，本試驗(yàn)選擇了溫度、pH值和亞硝酸鹽濃度3種環(huán)境脅迫因子進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示，Bc毒力基因的表達(dá)總體上是受溫度、pH值和亞硝酸鹽濃度影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，在溫度、pH值和亞硝酸鹽濃度3種環(huán)境脅迫因子影響下，CytK與PlcR均在3種因子得最高值時(shí)表達(dá)高效，原因在于CytK基因的表達(dá)是由CytK啟動(dòng)子序列上的plcR調(diào)節(jié)因子所控制，同時(shí)在CytK的氨基酸末端序列含有1個(gè)分泌信號(hào)的多肽，這種多肽能調(diào)控CytK毒素的分泌[15]。同時(shí)hblC也在3種因子的最高值時(shí)表達(dá)高效，與近年來在廣東順德、中山、惠州出現(xiàn)的中華鱉暴發(fā)病癥狀(腹甲有出血斑，頸部充血腫大，豎起身體浮于水面，以7月左右為發(fā)病的高峰期)[4]相一致。發(fā)病池塘夏季水溫較高，水中可能出現(xiàn)缺氧，造成中華鱉身體浮于水面。becT作為腸毒素基因在溫度25℃時(shí)表達(dá)高效，與黃顙魚患病時(shí)胃、腸道發(fā)白，腸內(nèi)無食，并且該病在每年的9—10月流行現(xiàn)象[7]相一致，而becT在pH值和亞硝酸鹽最高值時(shí)表達(dá)高效，水體中魚類死亡造成pH值和亞硝酸鹽含量增高，進(jìn)而加速becT基因表達(dá)。溫度和亞硝酸鹽濃度對(duì)nheA的影響要大于pH值，非溶血性腸毒素(nhe)的蛋白質(zhì)成分與hbl區(qū)別很大，不具有明顯的溶血性[15]，但和hblC一致是在溫度和亞硝酸鹽最高值時(shí)表達(dá)高效，共同作用毒力基因表達(dá)。

表13 環(huán)境脅迫因子對(duì)Bc致病性正交試驗(yàn)結(jié)果

表14 環(huán)境脅迫因子對(duì)Bc致病性正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

3.2 正交試驗(yàn)對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響

環(huán)境中同時(shí)存在或先后降臨的脅迫因素往往不是一種，而是多種。不同的脅迫因素之間有相互作用[16]。因此正交試驗(yàn)?zāi)芊从抄h(huán)境脅迫因子共同作用下對(duì)Bc毒力基因表達(dá)的影響。運(yùn)用正交試驗(yàn)研究環(huán)境脅迫因子不同比例條件下的Bc毒力基因表達(dá)，從而找到其表達(dá)高效時(shí)環(huán)境脅迫因子的配比。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，CytK基因表達(dá)量最高為第4組，即溫度25 ℃、pH值8.5、亞硝酸鹽濃度1.5 mg/L；而becT基因表達(dá)量最高為第1組，即溫度35 ℃、pH值8.5、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L；hblC、plcR、nheA基因表達(dá)量最高均為第9組，即溫度25 ℃、pH值6.0、亞硝酸鹽0.75 mg/L。在溫度較低時(shí)，弱堿和強(qiáng)堿均能使毒力基因表達(dá)高效，因此在溫度較低時(shí)，要控制水中的pH值來降低基因表達(dá)；當(dāng)溫度較高時(shí)，強(qiáng)堿更能使毒力基因表達(dá)高效。而水中亞硝酸鹽的含量在0.75、1.5 mg/L 水平時(shí)更能使毒力基因表達(dá)高效。

3.3 環(huán)境脅迫因子對(duì)Bc致病性的影響

環(huán)境脅迫因子對(duì)魚體的各種刺激對(duì)魚類具有致死性[17]，毋庸置疑其會(huì)嚴(yán)重影響水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)；即使是亞致死性的脅迫，也足以引起魚類的應(yīng)激反應(yīng)。雖說應(yīng)激反應(yīng)是機(jī)體的一種保護(hù)性反應(yīng)，但由于血液皮質(zhì)激素水平升高，使機(jī)體在對(duì)應(yīng)激原的反應(yīng)時(shí)有可能抑制機(jī)體特異性和非特異性的防御能力，并導(dǎo)致對(duì)病原的敏感性增高[18]。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響B(tài)c致死率的因素影響由大到小依次為溫度>亞硝酸鹽>pH值，其中溫度對(duì)致病性影響最強(qiáng)烈。低溫會(huì)嚴(yán)重影響熱帶和亞熱帶生活的水生動(dòng)物[19]。這印證了在第9組(溫度25℃、pH值6.0、亞硝酸鹽濃度0.75 mg/L)時(shí)，斑馬魚的致死率最高。斑馬魚在pH值為6.0時(shí)死亡率高，因?yàn)榈蚿H值對(duì)魚的感官和呼吸器官有毒害作用，使其攝食能力下降、耗氧量升高、生存能力減弱。此外，過低pH值會(huì)導(dǎo)致滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制失調(diào)，打破血液酸堿平衡，從而阻礙魚體生理生化機(jī)制的正常運(yùn)作[20]。亞硝酸鹽的毒性作用是由于亞硝酸鹽進(jìn)入血液后，將血紅蛋白分子的Fe2+氧化成為Fe3+，抑制血液的載氧能力，從而造成組織缺氧、神經(jīng)麻痹甚至窒息死亡[21-22]，加速魚類死亡。本試驗(yàn)雖然顯示環(huán)境脅迫因子對(duì)斑馬魚的致死率沒有顯著影響，但是在正交試驗(yàn)條件下環(huán)境脅迫因子對(duì)Bc毒力基因表達(dá)起支持作用，為預(yù)測(cè)實(shí)際養(yǎng)殖池塘中發(fā)病率的大小和其發(fā)病的危險(xiǎn)程度提供相關(guān)參考，以便于早做調(diào)節(jié)，減少損失。