謝 靖，陳 蕾，成家楊，唐 杰

(北京大學(xué)深圳研究生院，廣東深圳 518055)

隨著我國(guó)人口的增加和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，富含氮磷等廢水的大量排放已經(jīng)成為我國(guó)水環(huán)境污染的重要因素[1-2]。目前生活廢水、養(yǎng)殖廢水等富含氮磷廢水的處理，一般采用較為傳統(tǒng)的物理化學(xué)及生物處理方式，這些方法通過(guò)物理、化學(xué)或者微生物的作用將水中氮磷等污染物從水體中去除[3-4]，但是這個(gè)過(guò)程并沒有對(duì)污水中的營(yíng)養(yǎng)元素進(jìn)行有效利用，資源沒有得到有效利用，且其成本較大[5]。

水生植物在處理生活廢水及養(yǎng)殖廢水中因經(jīng)濟(jì)有效、資源利用率高等特點(diǎn)受到各國(guó)研究者的重視[6-7]。研究者利用水生植物如水葫蘆等大型水生植物處理廢水，水葫蘆等大型水生植物去除氮磷等污染物質(zhì)效率較高，但也存在植物體積大、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低且容易產(chǎn)生二次污染等問(wèn)題[8]。浮萍作為一種繁殖速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)、容易回收利用的小型水生植物，在去除水體污染方面尤其是生活廢水等方面有著巨大的潛力，同時(shí)浮萍可以快速積累淀粉和蛋白質(zhì)等可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在資源的利用方面同樣具有巨大的潛力[9-10]。

淀粉、蛋白質(zhì)是浮萍的主要營(yíng)養(yǎng)成分。研究表明，在適宜的條件下浮萍的淀粉干質(zhì)量含量可以高達(dá)75%，其淀粉含量大于木薯、馬鈴薯等傳統(tǒng)作物。據(jù)Cheng等估算，浮萍大約每年單位面積水域(1 hm2)可以積累28 t淀粉[11]，浮萍的干基蛋白質(zhì)含量在理想條件下也可達(dá)26.3%～45.5%[12]。但是，現(xiàn)有的研究對(duì)浮萍的淀粉積累和蛋白質(zhì)積累研究相對(duì)比較獨(dú)立[13-14]，難以綜合評(píng)價(jià)生長(zhǎng)條件對(duì)同一株浮萍的淀粉、蛋白質(zhì)含量及其積累能力的影響。筆者所在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)前期篩選獲得1株可以耐高氮磷含量(總氮含量50 mmol/L、總磷含量0.75 mmol/L)的浮萍植株，在適應(yīng)較高氮磷含量生活廢水、養(yǎng)殖廢水去除污染物方面具有巨大潛力。結(jié)合生物學(xué)識(shí)別及DNA測(cè)序分析，該浮萍植株被鑒定為青萍5508(LemnaaequinoctialisL. 5508)。本研究通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)該株青萍培養(yǎng)條件進(jìn)行設(shè)計(jì)和控制，優(yōu)化培養(yǎng)條件，探索培養(yǎng)條件對(duì)青萍淀粉、蛋白質(zhì)含量及其積累能力的影響，以期為綜合利用青萍淀粉及蛋白質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試青萍及培養(yǎng)條件

本試驗(yàn)用青萍5508(L.aequinoctialis5508)采自廣東惠州(地理位置114°29′27.8″E，22°52′47.3″N)。采集的青萍用自來(lái)水輕柔沖洗干凈后，置于底面直徑約為14 cm的塑料小桶內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)液為N-medium培養(yǎng)基[15][含0.15 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O，8 mmol/L KNO3，5 μmol/L H3BO3，13 μmol/L MnCl2·4H2O，0.4 μmol/L Na2MoO4·2H2O，1 mmol/L MgSO4·7H2O，25 μmol/L FeNaEDTA]。光照培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)條件設(shè)置如下：光照度為 8 000 lx，光—暗周期為16 h(25 ℃)—8 h(15 ℃)。在試驗(yàn)過(guò)程中，每天用去離子水補(bǔ)充蒸發(fā)散失的水分。培養(yǎng)20 d后收獲。

1.2 生長(zhǎng)條件對(duì)青萍生物質(zhì)影響

本試驗(yàn)選取5個(gè)因素研究生長(zhǎng)條件對(duì)青萍生長(zhǎng)的影響，各因素取4個(gè)水平。各因素及其水平如下：溫度，設(shè)為15、25、35、45 ℃；初始密度(投入青萍覆蓋水面的程度)，設(shè)為10%、30%、50%、70%；pH值，設(shè)為3.5、5.5、7.5、9.5；總氮含量，設(shè)為50、100、150、200 mg/L；總磷含量，設(shè)為5、20、50、100 mg/L。具體試驗(yàn)因素水平正交設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 青萍生物質(zhì)分析

1.3.1 青萍生物量的測(cè)定 將青萍從培養(yǎng)液中取出后，濾去自由水直至無(wú)水滴出現(xiàn)，將待測(cè)青萍均勻平鋪在吸水紙上，5 min 后測(cè)定其鮮質(zhì)量(g)。

將鮮青萍置于鼓風(fēng)干燥箱中，于65 ℃烘干24 h，經(jīng)過(guò)破碎機(jī)破碎得到青萍干粉待測(cè)定。

相對(duì)生長(zhǎng)率(relative growth rate，簡(jiǎn)稱RGR)=(lnNt-lnN0)/t。式中：Nt為收獲時(shí)青萍的生物量，mg；N0為投入時(shí)青萍的生物量，mg；t為培養(yǎng)周期，d。

1.3.2 青萍干基蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 稱取0.1 g青萍干粉于消化管中，加入催化劑(CuSO4)和5 mL濃硫酸，經(jīng)紅外消化儀(上海沛歐分析儀器有限公司，SKD-08S2)于450 ℃消化3 h，冷卻到室溫后加入過(guò)量強(qiáng)堿(濃NaOH溶液)，用凱氏定氮儀(上海沛歐分析儀器有限公司，SKD100)高溫蒸餾，并用已知含量和體積的鹽酸(過(guò)量)進(jìn)行吸收，最后用電位滴定儀(上海儀點(diǎn)科學(xué)儀器股份有限公司，雷磁ZDJ-5)滴定，計(jì)算樣品氮含量。通過(guò)樣品氮含量計(jì)算青萍蛋白質(zhì)含量：樣品蛋白質(zhì)含量(g)=樣品總氮含量(g)×12.5。

1.3.3 青萍淀粉含量測(cè)定 稱取10～15 mg青萍干粉于 50 mL 離心管中，加入10 mL 80%乙醇溶液，混勻后，置于 95 ℃ 恒溫水浴10 min，于1 500 r/min離心10 min，棄去上清液，重復(fù)上述乙醇提取步驟共3次，至上清液澄清；然后在 50 ℃ 恒溫水浴中蒸發(fā)掉剩余的乙醇，向剩余的固體中加入 4.0 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，混勻后，于50 ℃水浴30 min(水浴期間混勻2～3次)；然后加入5.0 mL 0.1 mol/L乙酸溶液，混勻后加入1 mL淀粉水解混合酶液(水解酶購(gòu)自Sigma公司，混合酶液含2 U/mL淀粉葡萄糖苷酶和 400 U/mL α-淀粉酶)，50 ℃水浴24 h。于2 500 r/min離心10 min，取上清液，用葡萄糖乳酸生物傳感器分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所，SBA-40E)檢測(cè)葡萄糖的含量。淀粉含量的計(jì)算公式如下：

1.3.4 青萍蛋白質(zhì)的氨基酸分析 將青萍干粉充分粉碎后，用酸(鹽酸)水解后用日立科技有限公司的氨基酸分析儀L-8900進(jìn)行氨基酸成分和含量的分析[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行分析和處理。在同一因素下各水平數(shù)據(jù)使用SPSS軟件，用Duncan’s法進(jìn)行多組樣本差異顯著性分析，并用不同小寫字母表示其顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)條件對(duì)青萍生物量的影響

如圖1所示，在所測(cè)試的5個(gè)影響因素中，最大RGR出現(xiàn)在25 ℃條件下，達(dá)到0.140，而最低RGR則出現(xiàn)在初始密度為70%的條件下，僅為0.064。青萍在各試驗(yàn)組生長(zhǎng)狀態(tài)良好，但在溫度組45 ℃的條件下，青萍已不能很好地繁殖擴(kuò)增，青萍生長(zhǎng)停滯甚至部分死亡，僅部分存活且生物量沒有增長(zhǎng)，可見過(guò)高的溫度會(huì)讓青萍的生長(zhǎng)受到限制，青萍品種并不能在45 ℃條件下正常生長(zhǎng)，因此在45 ℃條件下的數(shù)據(jù)未列出。

由圖1可以看出：(1)青萍在25 ℃條件下表現(xiàn)出最大的RGR(0.140)，且顯著(P<0.05)高于15、35 ℃時(shí)的RGR。(2)初始密度對(duì)青萍的生長(zhǎng)具有重要影響，RGR伴隨著初始密度的升高而升高，在30%初始密度條件下達(dá)到最大值，RGR為0.112，顯著大于其他各水平(P<0.05)；但隨著初始密度的繼續(xù)增加，RGR呈遞減趨勢(shì)，這表明在高密度條件下青萍的生長(zhǎng)受到了抑制，可能是由植株間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系造成的。(3)青萍的RGR總體伴隨著pH值升高而降低，在pH值為5.5的條件下青萍的RGR最大，為0.096，略大于pH值為 3.5 時(shí)的RGR(0.095)；當(dāng)pH值從5.5上升至7.5、9.5偏堿性條件下時(shí)，其RGR顯著下降(P<0.05)；在pH值為9.5的條件下其RGR達(dá)到最低值，為0.082，顯著低于其他pH值水平(P<0.05)，但青萍仍然處于生長(zhǎng)繁殖狀態(tài)?？梢娗嗥急憩F(xiàn)出對(duì)pH值的廣泛適應(yīng)性，在pH值范圍為3.5～9.5時(shí)均能生長(zhǎng)。Tang等報(bào)道，在太湖、巢湖流域廣泛存在青萍，且屬于優(yōu)勢(shì)種群，而青萍對(duì)環(huán)境pH值條件的廣泛適應(yīng)性很可能是其在自然水體中有著極其廣泛分布的重要原因之一[17-18]。(4)在總氮含量為50 mg/L的條件下，青萍的RGR最低，僅為 0.083，且顯著低于總氮含量其他水平(P<0.05)?？偟繛?00 mg/L時(shí)，RGR為0.097；隨著總氮含量進(jìn)一步增加至150 mg/L，RGR并未進(jìn)一步提高，反而出現(xiàn)一定程度的下降；但隨著總氮含量的繼續(xù)增大，RGR又恢復(fù)到100 mg/L含量條件下的水平。RGR在總氮含量為150 mg/L時(shí)突然下降，可能是由試驗(yàn)存在一定的生物學(xué)誤差造成的。總體來(lái)看，總氮含量高于100 mg/L時(shí)，總氮已經(jīng)不再是青萍生長(zhǎng)的限制條件，因此隨著總氮含量的進(jìn)一步增大，RGR并未顯著提高。(5)總磷含量對(duì)青萍的生長(zhǎng)也有顯著影響。隨著總磷含量的增加，RGR也增加并在總磷含量為20 mg/L時(shí)達(dá)到最大值(0.116)，且顯著(P<0.05)大于其他各水平的RGR。但是隨著總磷含量的進(jìn)一步增大，RGR呈遞減趨勢(shì)，在總磷含量為100 mg/L時(shí)降至最低值，為0.079。

綜合5個(gè)因素對(duì)青萍的RGR影響可以得出，最適合青萍生物量積累的培養(yǎng)條件為溫度25 ℃、初始密度30%、pH值5.5、總氮含量100 mg/L、總磷含量20 mg/L。

2.2 生長(zhǎng)條件對(duì)青萍淀粉含量的影響

如圖2所示，青萍在pH值為9.5時(shí)，淀粉含量達(dá)到最大值，達(dá)15.3%，在總磷含量為50 mg/L的條件下淀粉含量最低，為5.5%。

由圖2還可以看出：(1)溫度對(duì)青萍的淀粉含量有顯著影響。隨著溫度的升高，淀粉含量呈遞減趨勢(shì)。在較低溫度條件下(15、25 ℃)，青萍淀粉含量顯著(P<0.05)大于35 ℃條件下的淀粉含量。該結(jié)果與張飛等的研究結(jié)果[19]一致，表明低溫條件更有利于青萍淀粉的積累。(2)初始密度對(duì)青萍淀粉含量有重要影響。隨著初始密度的提高，淀粉含量逐漸上升。初始密度在10%、30%、50%的條件下，青萍的淀粉含量比較穩(wěn)定，為8%左右；當(dāng)初始密度達(dá)70%時(shí)，青萍淀粉含量會(huì)達(dá)到12.5%，顯著高于其他條件(P<0.05)。這與趙昭等關(guān)于生物量與淀粉積累的研究結(jié)論[20]一致，即青萍在較高生物密度條件下有利于淀粉的積累。(3)總氮含量對(duì)青萍淀粉含量的影響并不顯著。在 150 mg/L 總氮含量條件下，淀粉含量最高，為10.4%，在 200 mg/L 總氮含量條件下，淀粉含量最低(8.8%)。(4)總磷含量對(duì)青萍淀粉積累具有顯著影響。隨著總磷含量的升高，淀粉含量迅速降低，并在 50 mg/L 條件下達(dá)到最低值，淀粉含量為5.5%，隨后在 100 mg/L 總磷含量條件下，淀粉含量出現(xiàn)一定程度的上升，但仍顯著低于較低總磷含量(5 mg/L)下的淀粉含量(P<0.05)。

綜合以上結(jié)果，青萍淀粉含量的最優(yōu)條件為溫度15 ℃、初始密度70%、pH值9.5、總氮含量150 mg/L、總磷含量 5 mg/L。通過(guò)極差分析，對(duì)青萍淀粉積累影響程度最高的3個(gè)因素依次為pH值、總磷含量及溫度，總氮含量對(duì)青萍的淀粉含量積累影響最小。

理論上，提高青萍的生長(zhǎng)速率可以收獲更多的青萍生物量從而獲得更多的淀粉，但生長(zhǎng)速率與淀粉含量并不呈正相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，青萍的淀粉積累量與相對(duì)生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖1、圖2)。趙昭等曾指出，在青萍生長(zhǎng)的后期，淀粉的積累與生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系[20]；Xiao等也指出，青萍的淀粉含量與青萍的生長(zhǎng)速率呈現(xiàn)出一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系[13]。在實(shí)際應(yīng)用中，可以通過(guò)適當(dāng)降低青萍培養(yǎng)溫度、提高pH值等方法，降低青萍生長(zhǎng)速率，從而提高青萍的淀粉含量，以期收獲更高淀粉含量的青萍生物質(zhì)。

2.3 生長(zhǎng)條件對(duì)青萍蛋白質(zhì)含量的影響

由圖3可以看出，青萍在15 ℃的條件下，蛋白質(zhì)含量最高，為28.1%，在總磷含量為5 mg/L的條件下蛋白質(zhì)含量最低，為16.1%。

由圖3還可以看出：(1)溫度對(duì)青萍蛋白質(zhì)含量的影響表現(xiàn)為，在較低溫度下，蛋白質(zhì)含量較高。在溫度為15 ℃的條件下，蛋白質(zhì)含量最高，為28.1%，并顯著高于其他水平(P<0.05)。(2)初始密度對(duì)青萍蛋白質(zhì)含量影響顯著。在較低初始密度條件下，青萍蛋白質(zhì)含量較高，隨著初始密度的增加，蛋白質(zhì)含量逐漸下降。在10%的初始密度下，蛋白質(zhì)含量最高，為22.3%，并顯著高于其他各水平(P<0.05)；在70%的初始密度條件下，青萍蛋白質(zhì)含量最低，為17.3%。(3)青萍在偏酸性或者中性條件下，蛋白質(zhì)含量并沒有顯著變化，在堿性條件下其蛋白質(zhì)含量顯著下降。在pH值為9.5的條件下，其蛋白質(zhì)含量為17.9%，顯著低于其他pH值水平(P<0.05)。在pH值為3.5的條件下，青萍蛋白質(zhì)含量最高，為20.6%，略高于pH值為5.5、7.5條件下的蛋白質(zhì)含量。(4)總氮含量對(duì)青萍蛋白質(zhì)含量具有重要的影響。在較高總氮含量(200 mg/L)條件下，青萍具有最高的蛋白質(zhì)含量，為21.6%，并顯著高于其他各水平(P<0.05)，而在較低總氮含量(50 mg/L)條件下，青萍的蛋白質(zhì)含量最低，為 15.48%。張浩等在250 mg/L總氮含量下篩選得到較高蛋白質(zhì)含量的青萍[21]，與本試驗(yàn)結(jié)果較為接近，說(shuō)明總氮對(duì)蛋白質(zhì)積累有重要的影響。

綜合以上因素，青萍蛋白質(zhì)含量的最優(yōu)條件為溫度 15 ℃、初始密度10%、pH值3.5、總氮含量 200 mg/L、總磷含量20 mg/L。對(duì)青萍蛋白質(zhì)積累影響程度較高的3個(gè)因素依次為總磷、總氮、初始密度，pH值條件對(duì)青萍蛋白質(zhì)含量的積累影響最小。

值得指出的是，青萍的蛋白質(zhì)含量對(duì)應(yīng)總氮含量的變化與RGR對(duì)應(yīng)總氮含量的變化較為一致(圖1、圖3)，青萍的淀粉含量也隨著總氮含量增大而有一定的增大，但并不顯著。在實(shí)際應(yīng)用中，如果以利用青萍蛋白質(zhì)為目的進(jìn)行培養(yǎng)，可增加總氮含量，既可以提高RGR，也可以得到更高蛋白質(zhì)含量的青萍生物質(zhì)，取得更好的控制效果。

2.4 生長(zhǎng)條件對(duì)青萍淀粉、蛋白質(zhì)生產(chǎn)能力的影響

淀粉和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)能力也是優(yōu)化青萍培養(yǎng)條件的重要參考，表2為試驗(yàn)期內(nèi)各因素各水平的淀粉、蛋白質(zhì)的平均生產(chǎn)能力。

注：溫度的1～4水平分別對(duì)應(yīng)15、25、35、45 ℃；初始密度的1～4水平分別對(duì)應(yīng)10%、30%、50%、70%；pH值的1～4水平分別對(duì)應(yīng)3.5、5.5、7.5、9.5；總氮含量的1～4水平分別對(duì)應(yīng)50、100、150、200 mg/L；總磷含量的1～4水平分別對(duì)應(yīng)5、20、50、100 mg/L。

在25 ℃條件下，無(wú)論是淀粉還是蛋白質(zhì)的積累能力都是最高的。青萍的淀粉積累能力在較低的初始密度條件下較弱，初始密度的提高可以提高青萍對(duì)淀粉的積累速度，其蛋白質(zhì)積累能力則表現(xiàn)出在適中的初始密度下積累能力較強(qiáng)，過(guò)高或者過(guò)低的初始密度都會(huì)降低青萍積累蛋白質(zhì)的速度。相較于酸性環(huán)境，在偏堿性條件下，青萍淀粉積累速度較快；而蛋白質(zhì)積累能力則與之相反，在偏酸性條件下，青萍的蛋白質(zhì)積累能力較強(qiáng)，而在偏堿性條件下，蛋白質(zhì)積累能力較弱。在 100 mg/L 的總氮含量下，青萍的淀粉和蛋白質(zhì)積累能力都是最強(qiáng)的。在較低的總磷含量下，青萍的淀粉積累能力更強(qiáng)，20 mg/L 總磷含量青萍的蛋白質(zhì)積累能力最強(qiáng)，過(guò)高或者過(guò)低的總磷含量都會(huì)降低青萍積累蛋白質(zhì)的能力。

2.5 青萍的氨基酸組成及含量

在以青萍蛋白質(zhì)為原料進(jìn)行加工利用的實(shí)際生產(chǎn)中，其蛋白質(zhì)的氨基酸組成及含量是評(píng)價(jià)其作為蛋白質(zhì)原料質(zhì)量的重要依據(jù)。為了更好地評(píng)價(jià)青萍蛋白質(zhì)作為原料的利用價(jià)值，本研究分析了青萍的氨基酸組成及其含量。

表3結(jié)果表明，青萍樣品中氨基酸總量達(dá)197.10 mg/g，氨基酸含量最高的是天冬氨酸，達(dá)33.85 mg/g，占氨基酸總量的17.17%，其次是亮氨酸，為21.43 mg/g，占氨基酸總量的10.87%。必需氨基酸中亮氨酸含量最高，達(dá) 21.43 mg/g，占氨基酸總量的10.87%，其次是纈氨酸，為12.52 mg/g，占氨基酸總量的6.35%，含量最低的是甲硫氨酸，為 1.57 mg/g，占氨基酸總量的0.80%。需要特別指出的是，動(dòng)物第一限制性氨基酸賴氨酸在青萍中的含量較高，達(dá) 8.93 mg/g，占氨基酸總量的4.53%，占必需氨基酸的12.18%，高于常見飼料原料玉米、高粱、小麥等[13，22-23]。青萍的必需氨基酸總量達(dá)73.31 mg/g，占氨基酸總量(TAA)的37.20%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)為59.42%，這與世界衛(wèi)生組織(WHO)/聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)推薦的EAA/TAA=40%、EAA/NEAA=60%[21]非常接近。這些結(jié)果表明，青萍中蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，在利用其蛋白質(zhì)作為飼料原料等方面潛力巨大。

3 結(jié)論

(1)青萍在溫度為25 ℃、初始密度為30%、pH值為5.5、總氮含量為100 mg/L、總磷含量為20 mg/L的條件下，相對(duì)生長(zhǎng)速率最快；(2)青萍在溫度為15 ℃、初始密度為70%、pH值為9.5、總氮含量為150 mg/L、總磷含量為5 mg/L的條件下，淀粉含量達(dá)到最優(yōu)；(3)青萍在溫度為15 ℃、初始密度為10%、pH值為3.5、總氮含量為200 mg/L、總磷含量為 20 mg/L 的條件下，蛋白質(zhì)含量達(dá)到最優(yōu)；(4)在本試驗(yàn)周期內(nèi)，單位面積、單位時(shí)間積累的淀粉量最大的條件為溫度 25 ℃、初始密度50%、pH值9.5、總氮含量100 mg/L、總磷含量5 mg/L，而蛋白質(zhì)量最大的條件為溫度25 ℃、初始密度30%、pH值3.5、總氮含量100 mg/L、總磷含量20 mg/L；(5)青萍的氨基酸組成合理，接近WHO/FAO推薦的理想蛋白質(zhì)氨基酸模式，具有作為蛋白或飼料原料的潛力。

表3 青萍的氨基酸組成及含量

注：標(biāo)注“*”的表示必需氨基酸。

根據(jù)青萍在不同生長(zhǎng)條件下生物質(zhì)、蛋白質(zhì)及淀粉積累的特點(diǎn)，可在生產(chǎn)實(shí)際中有針對(duì)性地對(duì)青萍進(jìn)行控制，為青萍的種屬篩選以及蛋白質(zhì)、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)一步利用提供指導(dǎo)。