孫開瑜 徐銘恩,2* 周永勇

1(杭州電子科技大學(xué)生命信息與儀器工程學(xué)院，杭州 310018)2(浙江省醫(yī)學(xué)信息與生物三維打印重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)3(浙江省杭州捷諾飛生物科技股份有限公司，杭州 310018)

引言

骨移植對(duì)于修復(fù)由疾病或創(chuàng)傷引起的骨缺損至關(guān)重要。自體骨移植作為骨修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)，存在來源有限、引發(fā)感染、對(duì)自身造成殘疾等問題。近年來，利用組織工程技術(shù)研制合適的骨移植替代物以修復(fù)骨缺損成為研究熱點(diǎn)之一[1]。骨組織工程通過構(gòu)建替代傳統(tǒng)移植物的三維多孔支架作為細(xì)胞載體，支持成骨相關(guān)細(xì)胞增殖分化及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸，在骨修復(fù)中起著關(guān)鍵作用[2]。因此，制備一款力學(xué)性能與自體骨相近，具有良好生物相容性、可促進(jìn)細(xì)胞成骨分化的骨組織工程支架具有實(shí)際意義。

β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate，β-TCP)因其類似于人類骨骼的主要無機(jī)成分，作為人工骨替代材料具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性，且較羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)在體內(nèi)更易降解，在臨床上具有巨大的應(yīng)用潛力[3-4]。傳統(tǒng)制備多孔β-TCP支架的方法如化學(xué)/氣體發(fā)泡法、鹽析法、冷凍干燥法、熱致相分離法等[5-7]。這些方法難以控制支架形貌、孔隙率和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確限制孔徑大小在符合血管化和骨組織再生的200～500 μm范圍內(nèi)，使支架在微觀和宏觀形狀上無法滿足患者臨床上的特異性需要[8]。

3D打印技術(shù)作為一種新型數(shù)字化成型技術(shù)，與臨床計(jì)算機(jī)斷層掃描、磁共振成像等結(jié)合，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)個(gè)性化植入物，實(shí)現(xiàn)對(duì)孔隙結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)控制，設(shè)計(jì)出與患者骨缺損區(qū)域幾乎完全相同的三維多孔高活性骨修復(fù)支架，有利于提高植入支架的生物相容性[9-10]。Carrel等[11]通過3D打印技術(shù)制備特異性β-TCP/HA支架，孔隙率為50%～60%，大孔直徑約為250 μm，有效促進(jìn)皮質(zhì)骨的垂直生長(zhǎng)。但由于磷酸鈣陶瓷具有韌性較差、成形困難、在體內(nèi)降解較慢等缺點(diǎn)，在機(jī)械強(qiáng)度和降解速率中表現(xiàn)出局限性。目前，已有研究團(tuán)隊(duì)使用聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)等聚合物作為粘合劑溶解在有機(jī)溶劑中，使β-TCP漿料分布濃度均勻，擠出時(shí)具有一致性[12]。許國(guó)軍等將β-TCP、HA和PLA按比例溶于氯仿溶液中配置3D打印漿料,表現(xiàn)出良好的彈性性能便于成型[13]。然而，由于在制備支架過程中無法完全將有機(jī)溶劑從中去除，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[14-15]。同時(shí)，支架中鈣磷的含量受到限制，鈣磷相與聚合物存在相分離的傾向，從而降低了支架的力學(xué)性能和生物活性。因此，需提供新的加工方法和最佳漿料配方以滿足β-TCP支架3D打印的要求。

在天然骨中，纖維狀I(lǐng)型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要有機(jī)成分。I型膠原具有良好的生物相容性，且易于被人體吸收，為人工骨支架研究和應(yīng)用開辟新的方向。文獻(xiàn)報(bào)道，I型膠原與β-TCP結(jié)合使復(fù)合物具有骨誘導(dǎo)性，β-TCP/膠原復(fù)合物能模擬骨組織中的有機(jī)和無機(jī)成分,提供適合細(xì)胞生長(zhǎng)的三維環(huán)境[16]。Matsuno T等人[17]基于低溫3D打印技術(shù)打印膠原凝膠支架和膠原/β-TCP復(fù)合支架。但目前仍無法模仿天然骨膠原纖維結(jié)構(gòu)[18-19]。另外，由于制備中缺少燒結(jié)過程，引起支架的機(jī)械強(qiáng)度不足、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，對(duì)此尚未有成熟的解決辦法。因此，對(duì)β-TCP/膠原支架的制備工藝進(jìn)行改進(jìn)是亟待解決的問題。

本研究提出由β-TCP和I型膠原制備個(gè)性化可吸收的支架，以修復(fù)患者骨缺損。由于每個(gè)患者的骨缺損都有其外形和結(jié)構(gòu)特征，利用SolidWorks軟件設(shè)計(jì)個(gè)性化骨缺損修復(fù)三維支架模型，通過3D打印技術(shù)構(gòu)建多孔互連的β-TCP支架?？疾觳煌畛浣嵌鹊摩?TCP支架對(duì)支架內(nèi)部孔徑、力學(xué)性能的影響，選定最優(yōu)填充角度。對(duì)燒結(jié)后的β-TCP支架表面涂覆I型膠原，通過掃描電子顯微鏡(SEM)、機(jī)械彎曲測(cè)試等表征β-TCP/膠原支架，選擇適合的膠原濃度。在β-TCP/膠原支架上種植大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mBMSCs)，并通過觀察細(xì)胞活性和增殖來評(píng)價(jià)其生物相容性。利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)β-TCP/膠原支架對(duì)刺激mBMSCs向成骨細(xì)胞分化的相關(guān)蛋白在mRNA水平上的表達(dá)。研究結(jié)果表明，燒結(jié)的β-TCP支架和涂覆膠原的β-TCP/膠原支架有利于促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖。涂覆膠原的β-TCP/膠原支架對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖在體外成骨分化有顯著作用。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

1.1.1試劑及藥品

β-磷酸三鈣(β-TCP，杭州銘眾，中國(guó))；聚丙烯酸銨(9003-3-6，上海宛道，中國(guó))；甲基纖維素(9004-65-3，Sigma，美國(guó))；I型膠原(200110-10，杭州欣友，中國(guó))；Alamra Blue(Invitrogen，美國(guó))；DMEM高糖培養(yǎng)基(C1199550BT，Gibco，美國(guó))；FBS(085-150，Multicell，美國(guó))；Trizol(15596-026，Invitrogen，美國(guó))；活死細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(KGA502，南京凱基，中國(guó))；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A，Takara，日本)；SYBR Green熒光定量試劑盒(RR420A，Takara，日本)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)器材

生物3D打印機(jī)(Bio-Architect，Regenovo，中國(guó))；馬弗爐(SX3-2-12，杭州卓馳儀器有限公司，中國(guó))；電子分析天平(BSA224S,Sartorius，德國(guó))；酶標(biāo)儀(Multiskan GO，Thermo，美國(guó))；光學(xué)倒置顯微鏡(CX23 ,Olympus,日本)；掃描電子顯微鏡(JSM-6460,JEOL,日本)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7300，ABI，美國(guó))；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(HF90，Heal force，中國(guó))；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 15R，Heal Force，中國(guó))；精密pH計(jì)(PB-10，Sartorius，德國(guó))；百級(jí)潔凈工作臺(tái)(AHC-2D1，Esco，新加坡)。

1.2 三維打印制備β-TCP/膠原支架

用SolidWorks軟件設(shè)計(jì)骨修復(fù)支架模型結(jié)構(gòu)如圖1(b)所示。以可溶性鈣鹽和磷酸鹽反應(yīng)工藝合成的微納米級(jí)類球形β-磷酸三鈣(β-TCP)粉體為原料，以去離子水和聚丙烯酸銨(PAA-NH4)(2 wt% β-TCP)為溶劑，攪拌30 min，配制固相含量為32 vol%的漿料。將甲基纖維素(1 wt% β-TCP)加入漿料中，攪拌20 min。將制備好的β-TCP漿料填充到定制料筒中，置于Regenovo生物3D打印機(jī)的成型室中準(zhǔn)備打印。

圖1 (a)骨修復(fù)三維支架打印過程圖;(b)骨修復(fù)三維模型示意圖;(c)燒結(jié)后的β-TCP三維支架;(d)對(duì)β-TCP支架進(jìn)行膠原涂覆Fig.1 (a) Images representing the printing of the 3D bone repair model. (b) Schematic of three-dimensional bone repair model. (c) Representative images of sintered β-TCP scaffolds. (d)Images of collage gel coating on β-TCP scaffolds

為減小設(shè)計(jì)模型結(jié)構(gòu)和打印支架間的顯著差異,實(shí)驗(yàn)中所使用的Regenovo生物3D打印機(jī)重復(fù)定位精度(XYZ)為±0.01 mm。同時(shí)，應(yīng)用迭代反饋式生物打印技術(shù)(iterative feedback bio-printing，IFBP)保證打印支架的均一性[20]。確定打印平臺(tái)溫度為37℃，打印填充距離為0.8 mm，填充角度為0/90°、0/60°和0/45°，打印層厚0.28 mm，樣品大小為9 mm×9 mm×2 mm和5.5 mm×5.5 mm×4.0 mm3。生物3D打印機(jī)相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 生物3D打印機(jī)的主要參數(shù)

將打印好的β-TCP支架常溫干燥48 h。使用馬弗爐進(jìn)行1 200 ℃高溫?zé)Y(jié)，保溫時(shí)間為3 h，升溫/降溫速率為3℃/min。將燒結(jié)后的β-TCP支架，進(jìn)行高溫高壓滅菌處理，所得支架如圖1(c)所示。在無菌條件下，分別用0.50、0.25、0.10、0 mg/mL的膠原溶液涂覆滅菌后支架，37 ℃孵育2 h后，待支架表面膠原成凝膠化，超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干48 h，4℃存儲(chǔ)備用。

1.3 孔隙率測(cè)試

選用改良的比重瓶法對(duì)β-TCP支架的孔隙率進(jìn)行測(cè)試[21]。乙醇可以完全滲入孔中并且不改變?chǔ)?TCP支架材料的物理和化學(xué)性質(zhì)，因此用作支架的孔隙度值測(cè)量的液體。分別對(duì)填充角度為0/90°、0/60°、0/45°的β-TCP支架進(jìn)行孔隙率測(cè)量，每組對(duì)象測(cè)試4個(gè)樣品。

1.4 力學(xué)性能測(cè)試

采用Zwick/Roell萬能材料試驗(yàn)機(jī)，以不同填充角度(0/90°、0/60°、0/45°)的β-TCP支架和不同膠原濃度(0.50，0.25，0.10，0 mg/mL)涂覆的β-TCP/膠原支架為測(cè)定對(duì)象，尺寸大小為5.5 mm×5.5 mm×4.0 mm3立方體，每組對(duì)象測(cè)試4個(gè)樣品。以2 mm/min的加載速度在軸向壓縮下進(jìn)行力學(xué)性能測(cè)試，直至支架斷裂。通過應(yīng)力-應(yīng)變曲線得到支架的抗壓強(qiáng)度和壓縮彈性模量，確定合適的填充角度及膠原濃度。

1.5 掃描電鏡觀察

采用JSM-6460型電子顯微鏡，對(duì)干燥后的β-TCP支架和涂覆0.5 mg/mL膠原的β-TCP/膠原支架噴碳15 s，做好標(biāo)記，分別對(duì)兩組支架表面形貌進(jìn)行觀察。設(shè)置掃描電壓為15 kV，觀測(cè)×70倍的大孔結(jié)構(gòu)和×1 000倍的微觀結(jié)構(gòu)。

1.6 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mBMSCs)的提取及接種

根據(jù)文獻(xiàn)方法提取mBMSCs[22]。將凍存的mBMSCs放入37℃的振蕩水浴鍋中約80 s，將mBMSCs轉(zhuǎn)移到裝有H-DMEM培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，100 g離心5 min。吸棄離心后的上清培養(yǎng)液，加入適量H-DMEM培養(yǎng)基，將50 μL細(xì)胞懸浮液(2.0×104mBMSCs)分別接種在β-TCP支架和β-TCP/膠原支架上，放入培養(yǎng)箱中孵育1 h。然后每孔加入1 mL H-DMEM培養(yǎng)基，靜置于培養(yǎng)箱中(37℃，5% CO2)培養(yǎng)，之后每隔3 d更換一次培養(yǎng)基。

1.7 細(xì)胞增殖檢測(cè)

利用Alamar Blue試劑盒分別檢測(cè)β-TCP支架和涂覆0.5 mg/mL膠原的β-TCP/膠原支架內(nèi)細(xì)胞的增殖，每組對(duì)象測(cè)試4個(gè)樣品。將接種mBMSCs的支架培養(yǎng)于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，總計(jì)7 d。分別在第1、3、5、7 d，將Alamar Blue與細(xì)胞培養(yǎng)基以1∶10體積比混合后，以500 μL/mL取該混合溶液加入到每個(gè)樣品中。37℃孵育2 h后，從每個(gè)樣品吸取100 μL溶液至96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)544 nm/590 nm處的激發(fā)/發(fā)射值。移除支架內(nèi)殘留的檢測(cè)溶液并用PBS洗滌兩次，加入新鮮的培養(yǎng)基并放入二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.8 細(xì)胞活性檢測(cè)

用活死細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)5 d后β-TCP支架和涂覆0.5 mg/mL膠原的β-TCP/膠原支架中的細(xì)胞存活情況。從二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)5 d的三維支架，用DPBS分別洗滌培養(yǎng)的兩組支架3次，加入染色工作液。室溫下避光孵育1 h，吸出染色工作液終止孵育，用DPBS沖洗支架3次，熒光正置顯微鏡下觀察β-TCP支架和涂覆0.5 mg/mL膠原的β-TCP/膠原支架中的細(xì)胞形態(tài)和分布。

將接種mBMSCs的涂覆0.5 mg/mL膠原的β-TCP/膠原支架及β-TCP支架用4%多聚甲醛固定30 min，并在PBS配置的0.2% Triton X-100中透化。用PBS多次洗滌后，在室溫下使用DAPI對(duì)細(xì)胞核染色5 min，在顯微鏡下檢查染色。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)涂覆0.5 mg/mL膠原的β-TCP/膠原支架及β-TCP支架上成骨基因(ALP、Collagen-I、BSP)的表達(dá)情況，測(cè)試mBMSCs向成骨方向分化能力。分別取第1、3、7 d的mBMSCs，加入TRIzol 裂解液，按試劑說明進(jìn)行總RNA 提取，超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)檢測(cè)總RNA的純度和濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green熒光定量試劑盒，在7300plus(ABI)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)。

引物序列見表2，內(nèi)參基因選用GAPDH。ΔΔCT法分析β-TCP支架和β-TCP/膠原支架培養(yǎng)下細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)差異[23]。

表2 RT-PCR引物序列及產(chǎn)物片段

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，以P< 0.05作為差別有顯著性意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 支架的形貌

如圖2所示，利用3D打印技術(shù)制備的骨修復(fù)三維支架具有橫向通道及縱向通道，能準(zhǔn)確地再現(xiàn)SolidWorks 設(shè)計(jì)的三維結(jié)構(gòu)，孔道整齊有序，相互連通，具有較高的均一性，有利于提高結(jié)構(gòu)上抗壓能力。β-TCP支架打印后的微絲直徑為(351.87±11.62) μm，燒結(jié)后的微絲直徑為(303.49±9.37) μm，由燒結(jié)引起的支架收縮率為13.6%。圖3(a)為燒結(jié)后的β-TCP三維支架SEM圖像。β-TCP支架表面粗糙，內(nèi)部形成良好整齊的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙互相連通，大孔平均直徑為(315.30±6.85) μm，可供培養(yǎng)液深入結(jié)構(gòu)內(nèi)部。圖3(b)為β-TCP三維支架SEM圖像，在材料絲上可見許多近似圓形的微孔結(jié)構(gòu)，直徑分布在3～5 μm之間。圖3(c、d)為涂覆0.5 mg/mL膠原的β-TCP/膠原支架的表觀形貌，支架表面形成膠原涂層，孔徑和孔隙互連性在用膠原凝膠涂覆后無顯著變化。在β-TCP/膠原支架中觀察到膠原成網(wǎng)狀，形成的膠原納米纖維直徑約為50～500 nm。

表3 不同填充角度對(duì)支架性能的影響Tab.3 The effect of different filling angles on the performance of scaffolds

注：與0/90°填充角度支架比較，aP<0.05；與0/60°填充角度支架比較，bP<0.05。

Note：Comparing with 0/90° of filling angle,aP<0.05；Comparing with 0/90° of filling angle,bP<0.05.

圖2 燒結(jié)后的β-TCP支架。(a)俯視圖；(b)剖視圖Fig.2 Representative images of sintered β-TCP scaffolds. (a)Top view； (b) Sectional view

圖3 支架的掃描電鏡圖。(a)和(b)不同標(biāo)尺的β-TCP支架；(c)和(d)不同標(biāo)尺的β-TCP/膠原支架Fig.3 Representative SEM images of scaffolds. (a) and (b) β-TCP scaffolds with different scales (c) and (d) β-TCP/col scaffolds with different scales

2.2 填充角度對(duì)支架性能的影響

通過3D打印技術(shù)制備了填充角度為0/90°、0/60°和0/45°的β-TCP三維支架。從表3中可看出，填充角度對(duì)支架的孔徑大小和孔隙率影響較少，填充角度為0/90°、0/60°和0/45°的β-TCP支架孔徑分別為315.30、308.18、313.21 μm，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均無顯著差異。不同填充角度的β-TCP支架的光學(xué)顯微鏡圖如圖4所示。填充角度為0/90°的孔隙率為84.96%，略高于其他填充角度。通過對(duì)不同填充角度的支架力學(xué)性能分析，填充角度對(duì)支架抗壓強(qiáng)度和壓縮彈性模量有顯著影響，0/90°填充角度的β-TCP支架具有最高的抗壓強(qiáng)度為(15.02±0.82) MPa，壓縮彈性模量為(179.69±17.07) MPa，0/45°填充角度支架的抗壓強(qiáng)度最低為(8.30±1.21) MPa，壓縮彈性模量為(86.45±10.09) MPa，均在人體松質(zhì)骨抗壓強(qiáng)度2～12 MPa、壓縮彈性模量50～500 MPa范圍內(nèi)。0/90°是基礎(chǔ)β-TCP支架填充角度的最優(yōu)選擇。

2.3 膠原濃度對(duì)支架力學(xué)性能的影響

圖4 不同填充角度的β-TCP支架的光學(xué)顯微鏡圖。(a)0/90°；(b)0/60°(c)0/45°Fig.4 Representative SEM images of scaffolds. (a) 0/90° (b) 0/60° (c) 0/45°

圖5 不同膠原濃度的β-TCP/膠原支架的力學(xué)性能。(a)抗壓強(qiáng)度；(b)壓縮彈性模量(*P<0.05)Fig.5 Mechanical properties of β-TCP/col scaffolds with different collagen concentrations.(a)Compressive strength；(b)Elastic modulus(*P<0.05)

根據(jù)2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最優(yōu)填充角度0/90°，設(shè)定0 mg/mL膠原涂覆的β-TCP/膠原支架為control 組，對(duì)比不同膠原濃度下β-TCP/膠原支架的力學(xué)性能，每組對(duì)象測(cè)試4個(gè)樣品。由圖5(a)可見，干燥的β-TCP支架浸沒于液體后會(huì)降低其抗壓強(qiáng)度。β-TCP支架涂覆不同濃度的膠原溶液后其抗壓強(qiáng)度都有所降低。隨膠原濃度的增加而抗壓強(qiáng)度增加，抗壓強(qiáng)度都在2-12 MPa天然松質(zhì)骨的范內(nèi)。其中，0.5 mg/mL膠原濃度涂覆的β-TCP/膠原支架抗壓強(qiáng)度為(12.29±0.88) MPa。壓縮彈性模量表示支架的剛度。如圖5(b)所示，涂覆膠原會(huì)降低支架的壓縮彈性模量。0.5 mg/mL膠原涂覆的β-TCP/膠原支架的壓縮彈性模量為(116.74±27.75) MPa，與β-TCP支架(179.69±17.07) MPa間存在顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，涂覆膠原能提高支架的抗壓強(qiáng)度，減小β-TCP支架的壓縮彈性模量。

2.4 β-TCP/膠原支架和β-TCP支架對(duì)mBMSCs細(xì)胞活性的影響

采用Alamar Blue法對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測(cè)并繪制細(xì)胞增殖曲線，如圖6所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，β-TCP/膠原支架組和β-TCP支架組中mBMSCs數(shù)量都明顯增加，且β-TCP/膠原支架組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的細(xì)胞數(shù)均高于β-TCP支架組。在第5 d兩組之間表現(xiàn)出顯著性差異，到第7 d時(shí)β-TCP/膠原支架組的細(xì)胞數(shù)量與β-TCP支架組差異增大。 mBMSCs在β-TCP/膠原支架中增殖速度較快。β-TCP/膠原支架和β-TCP支架都具有良好的生物相容性，涂覆0.50 mg/mL膠原能促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

圖6 細(xì)胞在三維支架中的增殖(*P<0.05，**P<0.01)Fig.6 Cell proliferation on sintered β-TCP scaffolds or β-TCP/col scaffolds.(*P<0.05，**P<0.01)

通過DAPI染色及活死染色對(duì)比mBMSCs在β-TCP支架及β-TCP/膠原支架上第5 d的增殖情況。與Alamar Blue法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果一致，細(xì)胞在兩種支架細(xì)絲表面的分布數(shù)量相差明顯，在β-TCP/膠原三維支架中增殖更加旺盛，表面已完全鋪滿，細(xì)胞伸展充分，呈細(xì)長(zhǎng)梭形或星形，排列緊密，多層疊加。但β-TCP支架上，仍有少量mBMSCs未充分貼壁呈圓狀或橢圓狀，直徑大小不一。細(xì)胞在三維支架中的分布和形態(tài)如圖7所示。

圖7 細(xì)胞在三維支架中的分布和形態(tài)。 (a) 培養(yǎng)5 d的β-TCP支架的細(xì)胞DAPI染色圖； (b) 培養(yǎng)5 d的β-TCP支架的細(xì)胞活死染色圖，活細(xì)胞被染成綠色熒光；(c)培養(yǎng)5 d的β-TCP/膠原支架的細(xì)胞DAPI染色圖；(d)培養(yǎng)5 d的β-TCP/膠原支架的細(xì)胞活死染色圖Fig.7 mBMSCs cellular morphology on β-TCP scaffolds or β-TCP/col scaffolds. (a) and (c) Immunofluorescent staining of the intracellular nuclei with DAPI on either β-TCP scaffolds or β-TCP/col scaffolds after 5 days of culture; (b) and (d) Cell viability in either β-TCP scaffolds or β-TCP/col scaffolds after printing measured by Live & Dead viability assay kit, live cells were stained in green

2.5 β-TCP/膠原支架和β-TCP支架對(duì)mBMSCs成骨化影響

通過實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定，mBMSCs在β-TCP支架和β-TCP/膠原支架上培養(yǎng)1、3、7 d后的成骨基因的表達(dá)變化差異，包括早期分化標(biāo)志分子(ALP和Collagen-I)，晚期分化標(biāo)志分子(BSP)。如圖8所示，在培養(yǎng)期間，β-TCP/膠原支架中的mBMSCs在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)ALP、Collagen-I和BSP的相對(duì)表達(dá)量都較β-TCP支架高。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，ALP和Collagen-I在β-TCP支架上的相對(duì)表達(dá)量增長(zhǎng)緩慢，無顯著性差異，在β-TCP/膠原支架上的相對(duì)表達(dá)量上升趨勢(shì)明顯。其中第7 dALP的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)到4倍。第7 d時(shí)，Collagen-I在β-TCP/膠原支架上的相對(duì)表達(dá)量是β-TCP支架的1.9倍，呈極顯著差異。在β-TCP支架中，BSP的相對(duì)表達(dá)量無上升趨勢(shì)，而在β-TCP/膠原支架上第3天的相對(duì)表達(dá)量是β-TCP支架中的7倍，第7 d時(shí)上升至8倍。這一研究結(jié)果顯示，膠原涂覆的β-TCP/膠原支架促進(jìn)mMSCs向成骨細(xì)胞分化。

圖8 1，3和7 d后三維支架mBMSCs中成骨及礦化相關(guān)基因在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)(*P<0.05，**P<0.01)。(a)ALP； (b) BSP；(c)Collagen-IFig.8 The expression of genes related to osteoblastic differentiation and biomineralization relative to the housekeeping gene GAPDH in mBMSCs in β-TCP scaffolds or β-TCP/col scaffolds for 1,3 and 7 days(*P<0.05，**P<0.01). (a)ALP; (b) BSP; (c) Collagen-I

3 討論

生物3D打印能夠快速制造具有定制三維多孔結(jié)構(gòu)的骨組織支架，在臨床上展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)利用β-TCP具有良好骨結(jié)合性、骨傳導(dǎo)性、降解性及降解中釋放Ca、P離子利于新骨形成的特點(diǎn)，通過3D打印技術(shù)制備了具有多級(jí)孔結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)β-TCP支架。利用內(nèi)徑為0.35 mm錐形針頭打印的β-TCP支架微絲直徑為(351.87±11.62) μm。由于配置β-TCP漿料中使用聚丙烯酸銨、甲基纖維素等有機(jī)溶劑，在高溫?zé)Y(jié)過程中有機(jī)物的去除會(huì)使支架產(chǎn)生一定收縮，支架的微絲直徑為(303.49±9.37)μm，收縮率為13.6%[24]。燒結(jié)后的β-TCP支架通道結(jié)構(gòu)清晰，既有整齊排列的大孔結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的微孔結(jié)構(gòu)。大孔直徑約為(315.30±6.85) μm，滿足文獻(xiàn)中建議的大孔直徑在250-350 μm的范圍，以保證組織再生空間，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞遷移和物質(zhì)交換，避免由于較大孔徑引起機(jī)械強(qiáng)度的降低[25]。同時(shí)具備直徑3～5 μm的微孔(見圖3(b))，可能由水和有機(jī)物揮發(fā)形成，這些微孔形成液態(tài)微環(huán)境可以改善細(xì)胞的代謝環(huán)境，通過毛細(xì)管作用促進(jìn)液體和細(xì)胞的攝入[26]。

不同填充角度β-TCP支架的孔隙率分布在79%～85%之間，在天然松質(zhì)骨孔隙率為30%～90%的范圍內(nèi)。填充角度為0/90°的β-TCP支架的孔隙率最高，為84.96%±0.77%(見表3)。研究表明，高孔隙率且互連的骨支架在植入人體組織后期有利于細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)。填充角度對(duì)β-TCP支架的抗壓強(qiáng)度影響較大。填充角度為0/90°的β-TCP支架相比其他填充角度，在單位面積內(nèi)的接觸面積大于其他角度，根據(jù)力的作用與接觸面積成正比，其具有最高的抗壓強(qiáng)度(15.02±0.81) MPa，壓縮彈性模量為(179.69±17.07) MPa，力學(xué)性能達(dá)到了成人的天然松質(zhì)骨抗壓強(qiáng)度2～12 MPa和壓縮彈性模量50～500 MPa[27]。因此，0/90°是基礎(chǔ)β-TCP支架填充角度的最優(yōu)選擇。

為了在保持機(jī)械強(qiáng)度的基礎(chǔ)上更好地模仿天然骨的細(xì)胞外基質(zhì)，在填充角度為0/90°的β-TCP支架上涂覆了不同濃度的膠原凝膠模擬天然骨的膠原纖維結(jié)構(gòu)。比較不同膠原濃度對(duì)支架力學(xué)性能的影響，干燥的β-TCP支架與涂覆膠原β-TCP/支架在力學(xué)性能上成顯著性差異。β-TCP支架浸沒于液體后因溶解使支架材料顆粒體積逐漸縮小，導(dǎo)致顆粒與顆粒之間原先存在的連接發(fā)生顯微斷裂，材料顆粒彼此分離，降低其抗壓強(qiáng)度[28]。支架植入?yún)^(qū)為人體液體環(huán)境，其抗壓強(qiáng)度也會(huì)有所下降。涂覆濃度0.50 mg/mL的β-TCP/膠原支架表現(xiàn)出良好的力學(xué)性能，抗壓強(qiáng)度為(12.29±0.88) MPa，壓縮彈性模量為(116.74±27.75) MPa。β-TCP/膠原復(fù)合支架上分布著50～500 nm的膠原纖維(見圖3(d))，在負(fù)載作用下，跨越裂紋的膠原纖維網(wǎng)絡(luò)可能阻止裂紋擴(kuò)大及傳播，使受力部位裂隙發(fā)生偏斜產(chǎn)生大量基質(zhì)裂紋，裂紋越多產(chǎn)生的基質(zhì)碎片及斷裂面也就越多，能吸收更多的能量，為三維支架提供一定強(qiáng)度[29]。膠原有一定的親水性，其氨基可與β-TCP產(chǎn)物羥基磷灰石形成氫鍵，不但使二者結(jié)合緊密，而且提高了復(fù)合體的順應(yīng)性和延展性，降低了材料的彈性模量[29]。與Theinhan等構(gòu)建膠原/磷酸鈣骨水泥復(fù)合支架實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果相似[30]。

文獻(xiàn)報(bào)道，骨礦化發(fā)生前成骨細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷增殖分化的過程，其間又會(huì)受細(xì)胞和材料相互作用的控制[31]。在接種mBMSCs檢測(cè)β-TCP/膠原支架的生物相容性實(shí)驗(yàn)中，mBMSCs在涂覆膠原濃度0.5 mg/mL的β-TCP/膠原支架增殖更快(見圖6)。由于β-TCP支架前期表面細(xì)胞黏附能力不足，不利于細(xì)胞后期在整個(gè)結(jié)構(gòu)體中的持續(xù)增殖、遷移和發(fā)育。經(jīng)I型膠原涂覆后，mBMSCs在支架上的黏附和鋪展得到改善，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，彌補(bǔ)β-TCP支架因骨誘導(dǎo)性較差導(dǎo)致成骨性能有限的缺點(diǎn)。該現(xiàn)象在實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定中得到驗(yàn)證，在沒有骨誘導(dǎo)基因的刺激下β-TCP支架不能激活細(xì)胞進(jìn)行ALP表達(dá)，在β-TCP/膠原復(fù)合支架中ALP表達(dá)明顯(見圖8)。膠原納米纖維結(jié)構(gòu)的缺失會(huì)阻礙礦化過程。同樣，Collage-I和BSP相當(dāng)表達(dá)量的快速增長(zhǎng)，涂覆膠原可促進(jìn)基質(zhì)礦化。表明涂覆膠原濃度為0.5 mg/mL的β-TCP/膠原支架比單純的β-TCP支架更好地表達(dá)成骨特性，可刺激基質(zhì)礦化，有利于促進(jìn)mBMSCs向成骨細(xì)胞分化。

4 結(jié)論

本研究提出了基于3D打印技術(shù)制備個(gè)性化的多孔β-TCP/膠原支架來修復(fù)骨缺損的方法。通過3D打印技術(shù)打印制備出整個(gè)與患者缺損區(qū)吻合且具有一定三維內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)的β-TCP/膠原支架。該支架具有不同尺度上的分級(jí)結(jié)構(gòu)，可滿足成骨細(xì)胞的粘附和鋪展，適合血管化和骨組織再生。支架的力學(xué)性能與天然松質(zhì)骨相似。在β-TCP支架上涂覆膠原后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架上的生物相容性提高，有更高的ALP活性、成骨基因Collage-I和BSP表達(dá)，細(xì)胞向成骨方向分化能力得到提升。因此，該方法制備的β-TCP/膠原支架適合于骨組織再生，為后續(xù)個(gè)性化的骨缺損修復(fù)研究提供一定參考。