張曉梅 ，王冠元 ，韓 靜 ，孫予璇 ，李慶忠 ，謝承志

（1.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部,天津300060；3.煙臺(tái)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，煙臺(tái)264005）

鋁是地球上含量最多的金屬元素，在生產(chǎn)生活領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用，如水處理、食品添加劑、藥品、電化學(xué)、輕合金的生產(chǎn)等[1-3]。然而，過量的鋁會(huì)引起人體特定組織和細(xì)胞的損害，導(dǎo)致健康問題，如低色小紅細(xì)胞性貧血、鋁相關(guān)性骨骼疾病(ARBD)、腦病、癡呆、肌肉病變、阿爾茨海默癥和帕金森病等[4-6]。另外，鋁離子還會(huì)產(chǎn)生生物代謝性的危害，如鋁離子會(huì)影響體內(nèi)的鈣和硒的吸收代謝[7]。此外，人們認(rèn)為，世界上近40%的酸性土壤是由鋁毒污染的，這是妨礙植物（如農(nóng)作物）在酸性土壤中生長的關(guān)鍵因素[8]。選擇性識(shí)別和檢測(cè)鋁離子，對(duì)生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)研究具有十分重要的意義。熒光探針分析法具有選擇性好、靈敏度高以及操作簡單等優(yōu)勢(shì)，因此設(shè)計(jì)合成特異性識(shí)別鋁離子的熒光探針成為近年來的研究熱點(diǎn)之一。雖然目前已有的鋁離子熒光化學(xué)傳感器無論是選擇性、靈敏性，還是檢測(cè)限、響應(yīng)速度，普遍具有較好的理化特性,但是，該類化學(xué)傳感器往往需要復(fù)雜的合成過程，能夠通過簡單一步反應(yīng)合成的報(bào)道較少。而且，大多數(shù)水溶性差，不易在水體系中進(jìn)行熒光檢測(cè)，故難以開發(fā)細(xì)胞成像，不能實(shí)現(xiàn)相應(yīng)熒光探針在細(xì)胞層次或者組織層次上進(jìn)行鋁離子的生理、生化行為的研究[9-11]。基于上述發(fā)展?fàn)顩r，我們將煙酰肼和羥基萘醛通過縮合反應(yīng)合成一個(gè)席夫堿配體，并研究其在溶液及細(xì)胞內(nèi)的鋁離子熒光檢測(cè)能力。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑 所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水由Labconco WaterPro水系統(tǒng)制備，煙堿肼(阿拉丁試劑)，2-羥基-1-萘甲醛(安耐吉化學(xué))，硝酸鋁(天津市化學(xué)試劑六廠)，甲醇(天津市化學(xué)試劑六廠)，復(fù)方氫氧化鋁片 (山西云鵬制藥有限公司)，MCF-7細(xì)胞（美國ATCC細(xì)胞庫）

1.2 儀器 RF-5301型熒光分光光度計(jì)，Nicolet380傅立葉變換紅外光譜儀，Bruker AVANCE III 400 MHz核磁共振波譜儀，LCQ電噴霧質(zhì)譜儀，尼康Nikon ECLIPSE Ti全自動(dòng)倒置顯微鏡。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 探針化合物L(fēng)的合成 參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，化學(xué)反應(yīng)如圖1所示。稱取2-羥基-1-萘甲醛1.72 g(10 mmol)置于圓底燒瓶中，用20 mL無水乙醇溶解，稱取煙堿肼1.37 g(10 mmol)，用20 mL無水乙醇溶解，置于恒壓滴液漏斗中，緩慢滴入圓底燒瓶。設(shè)定油浴溫度為100℃，加熱攪拌回流5 h，反應(yīng)過程中用TLC檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾餅再用甲醇重結(jié)晶1次，得黃色結(jié)晶2.13 g，產(chǎn)率73.12%。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ（ppm）12.60（s，1H，OH-Ar）,12.37（s，1H，-NH-），9.47 （s，1H，=CH），7.24～9.15（m，10H，HAr）.IR（KBr cm-1）：υC=O1 692.3，υ（Schiff-base）C=N1 597.1。

圖1 探針分子L的合成Fig 1 Synthesis of probe L

1.3.2 探針化合物L(fēng)的熒光性質(zhì)研究

1.3.2.1 靈敏性實(shí)驗(yàn)：將5 μL 1.0×10-4mol/L探針化合物L(fēng)加入到2 mL甲醇，Tris-HCl緩沖溶液為9∶1混合溶劑的樣品池中（終濃度為2.5×10-7mol/L），然后逐漸加入1.0×10-5mol/L硝酸鋁的甲醇溶液（每次5 μL），測(cè)試熒光光譜。

1.3.2.2 選擇性實(shí)驗(yàn)：2.5×10-7mol/L探針L溶液，分別加入 K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+、Mn2+、Hg2+、Al3+溶液（K+、Ca2+、Na+、Hg2+的濃度是L濃度的50倍，Cd2+、Mn2+的濃度是L濃度的10 倍，Mg2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+的濃度是 L 濃度的5倍，Al3+的濃度是L濃度的1倍），待金屬與L充分反應(yīng)后，測(cè)試熒光光譜。

1.3.2.3 Job’s-Plot方法確定L與A13+結(jié)合的配位比：保持配體L與Al3+的總濃度不變（終濃度為5×10-7mol/L），改變配體L與Al3+摩爾比測(cè)定其熒光強(qiáng)度值。

1.3.3 細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn) 乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）培養(yǎng)借鑒于美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫ATCCHB-8065，通過含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS）的完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。使用倒置熒光顯微鏡拍攝加入鋁離子前后的細(xì)胞熒光成像。

2 結(jié)果

2.1 探針L的熒光性能研究

2.1.1 靈敏性 在甲醇：Tris-HCl緩沖溶液為9：1的混合溶劑中，配體L與加入的不同濃度的硝酸鋁溶液充分反應(yīng)后，在波長為409 nm的光激發(fā)下進(jìn)行熒光光譜測(cè)試。從圖2可以看出，隨著Al3+的加入，L可產(chǎn)生顯著的熒光增強(qiáng)趨勢(shì)，并隨著鋁離子的濃度增大而增強(qiáng)，最大發(fā)射峰位于458 nm和480 nm處。此外，鋁離子濃度在0～0.3 μmol/L范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度保持了良好的線性關(guān)系。以I/I0→1對(duì)[Al3+]作圖，根據(jù)IUPAC對(duì)于檢測(cè)限的定義，根據(jù)公式DL=K×Sb1/S（K取3，Sb1為空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為校準(zhǔn)曲線的斜率）計(jì)算，能得到配體檢測(cè)金屬離子的最低濃度，即配體L對(duì)金屬離子的檢測(cè)限為 2.3×10-9mol/L。

圖2 探針分子L在甲醇/Tris-HCl混合溶劑中的Al3+熒光滴定譜圖Fig 2 Fluorescence emission changes of L in methanol/Tris-HCl solution upon the addition of increasing amount of Al3+

2.1.2 選擇性 配體L與加入的不同金屬離子充分反應(yīng)后，進(jìn)行熒光性質(zhì)考察。以波長409 nm光源為激發(fā)光，測(cè)得熒光強(qiáng)度變化情況如圖3所示?？梢钥闯觯潴w探針L加入不同金屬離子的熒光強(qiáng)度變化不同，雖然其它各種金屬離子在溶液中濃度顯著高于配體探針 L（K+、Ca2+、Na+、Hg2+的濃度是 L濃度的50倍，Cd2+、Mn2+的濃度是L濃度的10倍，Mg2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+的濃度是 L 濃度的 5 倍，Al3+的濃度是L濃度的1倍），加入其它常見金屬離子充分反應(yīng)后，配體L熒光強(qiáng)度沒有較大改變；加入Al3+時(shí)，配體L響應(yīng)非常明顯，由此確定熒光探針L對(duì)鋁離子具有較好的選擇性。

圖3 探針分子L在甲醇/Tris-HCl混合溶劑中，加入不同金屬離子的熒光光譜(λex=409 nm)Fig 3 Fluorescence spectra of probe L in the presence of various metal ions in methanol/Tris-HCl solution(λex=409 nm)

2.2 L與A13+結(jié)合配位比的確定 了解金屬離子與有機(jī)配體間的配位比例，可以為確定配合物的結(jié)構(gòu)及闡明熒光增強(qiáng)的機(jī)理提供重要信息。保持配體L與Al3+的總濃度不變（5×10-7mol/L），Al3+的濃度占總濃度的比例在0～1之間變化，通過繪制熒光強(qiáng)度與相應(yīng)Al3+所占濃度比值的線性曲線，擬合得到L與Al3+絡(luò)合的配位比，得到如圖4所示的結(jié)果。由Job’s plot曲線可以看出，當(dāng)[Al3+]/[Al3++L]的比值在0.33左右，即Al3+與L的配比為1：2時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最高點(diǎn)，因此可以推測(cè)出，鋁離子結(jié)合兩個(gè)配體形成配合物。為了進(jìn)一步確定A13+與L的結(jié)合方式，采用ESI-MS譜對(duì)Al3+-L形成的復(fù)合物進(jìn)行了表征。質(zhì)譜中出現(xiàn)的強(qiáng)峰（m/z 607.2），其對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)為[Al（L）2]+（calcd m/z 607.2）。

2.3 細(xì)胞成像研究 給藥配體設(shè)置為10 μmol/L，溶液為PBS緩沖溶液，給藥1 h后顯微鏡下觀察拍照。拍照完成后，再往配體組加入15 μmol/L的Al（NO3）3，給藥1 h后觀察拍照。由圖5可以看出，在細(xì)胞中外加Al（NO3）3后，可以觀察到非常明顯的熒光現(xiàn)象，表明探針分子可進(jìn)入細(xì)胞檢測(cè)過量的鋁離子。

圖4 探針分子L與Al3+的熒光Job's plot曲線(λex=409 nm)Fig 4 Job plot of probe L with Al3+based on fluorescence spectra

圖5 探針分子L在乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）中的細(xì)胞成像圖Fig 5 Fluorescent imaging of probe L in MCF-7 cells

2.4 量化計(jì)算 用Gaussian 09程序包[13]，采用密度泛函理論（DFT），在 B3LYP 水平用 6-31+G（p，d）基組，對(duì)探針分子L和形成的2∶1配合物進(jìn)行構(gòu)型優(yōu)化。優(yōu)化的分子結(jié)構(gòu)見圖6，可以看到萘環(huán)上羥基的氫原子和C=N雙鍵上氮原子的距離為1.828?，O-H…N角度為142.5°，形成分子內(nèi)氫鍵，符合激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）機(jī)制。L及其鋁配合物的前線分子軌道圖見圖7，最高占據(jù)軌道HOMO的能量分別為-5.899 eV和-7.719 eV，最低空軌道LUMO的能量分別為-2.372 eV和-5.398 eV，說明配合物具有更好的熱穩(wěn)定性。L和配合物的HOMO電子云主要集中在羥基取代的萘環(huán)上，而LUMO的電子云分布在整個(gè)分子，符合分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）機(jī)制。

圖6 探針分子L的優(yōu)化構(gòu)型圖Fig 6 Optimized structures of probe L

圖7 探針分子L與AlL2配合物的HOMO和LUMO軌道能級(jí)圖Fig 7 Views of HOMO and LUMO of probe L and AlL2

3 討論

本文合成了一種煙酰肼席夫堿熒光探針，其合成原料便宜，制備簡便，結(jié)構(gòu)通過紅外譜圖和核磁譜圖得以確認(rèn)。光譜研究顯示，探針L在甲醇-水緩沖溶液中對(duì)Al3+具有良好的選擇性，其檢測(cè)限可達(dá)到納摩爾級(jí)別，通過質(zhì)譜和Job’s plot曲線可確定探針分子L與Al3+形成2∶1的穩(wěn)定絡(luò)合物。該探針對(duì)Al3+的響應(yīng)可以歸于ESIPT機(jī)制[14]和ICT機(jī)制[15]，并通過量化計(jì)算證明。探針分子羥基的氫原子和C=N雙鍵上氮原子形成分子內(nèi)氫鍵，存在激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)現(xiàn)象，加入鋁離子后，發(fā)生去質(zhì)子化作用，抑制了探針分子的ESIPT進(jìn)程，因而熒光增強(qiáng)。分子具有較大的極性和明顯的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng)，與鋁離子結(jié)合后對(duì)熒光團(tuán)的推-拉電子作用產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致熒光光譜的變化。由于探針分子在水體系下也可以發(fā)射出很強(qiáng)的熒光，因此可用于檢測(cè)藥物及生命體系的鋁離子含量。本實(shí)驗(yàn)制備的新型探針L是一種靈敏度極高并具有很強(qiáng)選擇能力的Al3+熒光探針，有望應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。