趙 慧 ，王春花 ，孫 蕊 ，謝 彤 ，穆 成 ，王志銳 ，巨韓芳 ，朱 澤

（1.天津醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系，天津300070；2.天津市結(jié)核病控制中心結(jié)核參比室，天津300041）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染性疾病，我國是全球高負擔(dān)國家之一[1]。結(jié)核病的診斷與防治一直是我國結(jié)核病控制工作面臨的重點。早期快速診斷對于結(jié)核病的治療和預(yù)防控制起著重要的作用。結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)實驗耗時較長，使用固體改良羅氏培養(yǎng)基（Lowenstein-Jensen，L-J）培養(yǎng)常常需要20 d～2個月，即使采用較先進的全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統(tǒng)做液體培養(yǎng)也需要7～20 d左右。實驗室最常用的方法是痰標(biāo)本直接涂片法，此法操作簡單、價格低廉，但是操作起來比較費時，而基層痰檢實驗室在涂片量大的情況下1 d之內(nèi)無法得出結(jié)果，這樣的現(xiàn)狀遠遠不能滿足結(jié)核病臨床和防治工作的需要。近年來，熒光染色技術(shù)得到了飛速發(fā)展，作為一種研究方法或?qū)嶒炇侄?，已被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)各種基礎(chǔ)理論研究和臨床診斷。目前，金胺O熒光染色也逐漸應(yīng)用在結(jié)核分枝桿菌的痰涂片檢測上。本文對傳統(tǒng)的萋-尼氏抗酸染色法（簡稱Z-N）和熒光染色兩種染色方法在結(jié)核分枝桿菌痰涂片鏡檢過程中的檢測效能進行了初步的比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 580例標(biāo)本均來自于2012年8-12月天津市結(jié)核病控制中心門診部收取的病人送檢痰液。

1.1.2 試劑和儀器 抗酸染色試劑盒和金胺O染色試劑盒，購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，LED熒光顯微鏡（carl ZEISS Primo Star iLED），圖像采集系統(tǒng)（ZEN.exe 1.0.1.0），Milli-Q Integral 3（A 10），NUAIR classⅡ生物安全柜（MODEL NO.NU-425-600E），BACTEC MGIT 960 （Becton Dickinson&Company）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的確認 痰標(biāo)本排除口水痰后納入研究范圍。確認納入的當(dāng)天，每份痰標(biāo)本取相同位置痰液制成兩張涂片。

1.2.2 涂片染色鏡檢 每份痰樣品各涂片2張，分別進行Z-N和熒光染色。染色時，Z-N法復(fù)紅染色時采用加熱5 min，熒光染色采用金胺O冷染15～20 min。鏡檢時，Z-N法在1000×鏡下觀察，金胺O法在400×鏡下觀察。具體的方法及報告標(biāo)準參見文獻[2]。

1.3 陰性對照組實驗 用高壓滅菌后的磷酸鹽緩沖液（PBS pH=6.8）作為樣本，制作60張涂片，30張為一組，第一組采用Z-N法涂片，第二組采用熒光染色法涂片。

1.4 分枝桿菌全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統(tǒng)培養(yǎng) 采用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)進行樣本培養(yǎng)，實驗方法及結(jié)果判定參照文獻[2]。

1.5 讀片時間統(tǒng)計 對納入的580張涂片進行讀片時間的記錄，統(tǒng)計兩種染色法對同一標(biāo)本各自的讀片時間。

1.6 質(zhì)量控制 所有參與研究的人員都是經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的實驗室技術(shù)人員。納入標(biāo)本的涂片和鏡檢，均由同一名實驗人員完成。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 兩率之間的比較采用χ2檢驗，兩種方法讀片時間上的比較采用t檢驗，P＜0.05即為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Z-N法和熒光染色法與培養(yǎng)結(jié)果的比較 580份痰標(biāo)本抗酸染色法陽性檢出率為10.8%，熒光染色法陽性率為15.3%，兩種方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.118，P＜0.05）（表 1，圖 1）。

表1 Z-N法和熒光染色法與培養(yǎng)結(jié)果的比較Tab 1 ComparisonbetweenZ-Nandfluorescentstainingandculture

圖1 兩種染色方法及培養(yǎng)陽性數(shù)的比較Fig 1 Comparison betweentwostainingmethodsandpositivenumber of culture

2.2 不同檢測方法的結(jié)果分析 見表2、3。兩種染色方法的診斷符合率無統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=1.917，P＞0.05），見表4；Z-N正確診斷指數(shù)（即約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1）為0.398 7，熒光染色正確診斷指數(shù)為0.545 8。

表2 Z-N法與培養(yǎng)的檢測結(jié)果分析（n）Tab 2 AnalysisoftheresultsofZ-Nandculture （n）

表3 熒光染色法與培養(yǎng)的檢測結(jié)果分析（n）Tab 3 Analysisoftheresultsoffluorescentstainingandculture （n）

表4 兩種染色方法檢測對比Tab 4 Comparisonbetweentwostainingmethods

2.3 對每一例標(biāo)本在兩種染色方法中進行分級比較 對每一級別的結(jié)果進行χ2檢驗，結(jié)果表明兩種染色方法在各陽性分級比較中沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。另外，在陰性對照組30例中，有1例在熒光染色時，20×物鏡下見到兩條疑似結(jié)核桿菌，在油鏡下確認為并非結(jié)核桿菌（表5、6）。

表5 實驗組Z-N染色和熒光染色結(jié)果的分級比較[n(%)]Tab5 ClassificationcomparisonbetweenZ-Nandfluorescentstaining intheexperimentalgroup [n(%）]

表6 陰性對照組Z-N染色和熒光染色的結(jié)果Tab 6 Results of Z-N and fluorescent staining in negative control group

2.4 兩種方法讀片時間比較 觀察580張涂片，抗酸染色累計用時2 505 min，平均用時4.32 min/張；熒光染色累計用時1 220 min，平均用時2.10 min/張。兩種方法的時間用t檢驗，結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）?？梢?，熒光染色法的效率遠遠高于抗酸染色法。見表7，圖2～9。

表7 兩種染色方法的讀片時間分析Tab 7 Analysisofthereadingtimebythetwomethods

圖2 熒光染色+（10×40）Fig 2 Fluorescent staining+（10×40）

圖3 熒光染色++（10×40）Fig 3 Fluorescent staining++（10×40）

圖4 熒光染色+++（10×40）Fig 4 Fluorescent staining+++（10×40）

圖5 熒光染色++++（10×40）Fig 5 Fluorescent staining++++（10×40）

圖6 抗酸染色+（10×100）Fig 6 Z-N+（10×100）

圖7 抗酸染色++（10×100）Fig 7 Z-N++（10×100）

圖8 抗酸染色+++（10×100）Fig 8 Z-N+++（10×100）

圖9 抗酸染色++++（10×100）Fig 9 Z-N++++（10×100）

3 討論

隨著實驗室診斷技術(shù)的進步，分子檢測技術(shù)被更多地運用到痰標(biāo)本檢測中。其中多色巢式熒光定量PCR（Xpert MTB/RIF）無論在靈敏度還是特異度方面都遠遠高于傳統(tǒng)的細菌學(xué)檢測[3]，但是考慮到明顯的成本效益和普及程度，痰涂片鏡檢在國家結(jié)核病控制規(guī)劃中仍是最有效的病人發(fā)現(xiàn)方法，傳統(tǒng)的萋-尼氏染色鏡檢是目前國內(nèi)主要的鏡檢方式[4]。不論是從結(jié)核病控制、流行病學(xué)調(diào)查和研究，還是從臨床診療的角度看，分枝桿菌的分離培養(yǎng)都是結(jié)核病病原學(xué)診斷的“金標(biāo)準”[2]。本次研究中，以分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果為參照分析，熒光染色靈敏度（57.58%）高于Z-N靈敏度（41.67%），而兩種方法的特異度相差不大，診斷符合率也無統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=1.917，P＞0.05）；在正確診斷指數(shù)（即約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1）方面，熒光染色（0.545 8）要高于Z-N（0.398 7），而約登指數(shù)越高，說明篩查實驗的效果越好，真實性越大。綜合多組實驗數(shù)據(jù)，說明熒光染色法診斷效果優(yōu)于抗酸染色法。

有文獻報道[5]熒光染色法檢測痰中結(jié)核桿菌的靈敏度高，特異性和準確率也比較高。也有報道稱[6]，熒光染色法特異性與抗酸染色法相似，但敏感性平均要高10%，本次實驗結(jié)果與其相一致。也有報道[7]顯示，對于結(jié)果為1+的標(biāo)本，兩種染色方法的檢出率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而對于結(jié)果為±，2+,3+,4+的標(biāo)本，兩種方法的檢出率無明顯差異，表明兩者陽性率的差異主要體現(xiàn)在含菌量較少的痰液標(biāo)本。本實驗與其研究并不一致，這可能與本次實驗標(biāo)本收集時間短，數(shù)據(jù)少有關(guān)。

在操作上，抗酸染色法較熒光染色法繁瑣，加熱時易產(chǎn)生氣溶膠。熒光染色鏡檢抗酸桿菌在暗色背景下會發(fā)出橙黃色熒光，醒目易發(fā)現(xiàn)。并且熒光染色在20×物鏡視野大，鏡檢速度快，而抗酸染色100×油鏡視野小，鏡檢速度較慢。鏡檢時間的分析顯示，鏡檢580份涂片，熒光染色法的鏡檢時間要遠遠低于抗酸染色法的鏡檢時間。這對工作效率的提高有著重要的意義。有資料表明，熒光染色的假陽性率可高達5.9%，本研究結(jié)果與之相近，在30例陰性對照標(biāo)本中，其中有1例在熒光染色時，20×物鏡下見到兩條疑似結(jié)核桿菌，在油鏡下確認為并非結(jié)核桿菌。故對于菌量少的樣本，在高倍鏡下觀察仍為疑似者，要在油鏡下再次確認其形態(tài)，方可得出結(jié)論。另外，實驗中造成假陽性可能原因為熒光染色鏡檢使用的放大倍數(shù)（400×）較Z-N法鏡檢（1 000×）低，所以在菌量少的情況下，加上雜質(zhì)也會有熒光顯色的干擾，鏡下對菌體形態(tài)不容易辨認[8]。

本研究結(jié)果表明，熒光染色鏡檢的敏感度比ZN法鏡檢提高15%多，特異度并沒有明顯降低；另外熒光染色鏡檢可以明顯縮短讀片時間，且染色無需加熱。所以使用熒光染色法鏡檢痰涂片，是一種快速、靈敏的檢測方法[9-11]。同時，該方法若配套圖像采集系統(tǒng)，能更直觀的看到菌體情況，為臨床診斷和患者提供更快捷、更直接的報告方式。熒光染色法更適用于日工作量較大，并且人員鏡檢經(jīng)驗豐富的實驗室。