吳紅學(xué)，童仕倫，柯東，鄒力

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060)

根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，胃癌發(fā)病率位于惡性腫瘤第5位、病死率居第3位[1]。中國是胃癌的高發(fā)地區(qū)之一，發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%[2]。隨著中國人民生活水平的提高，生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，胃癌的發(fā)病率仍呈上升趨勢[3]。胃癌的治療近年來雖取得一定進(jìn)展，但以手術(shù)為主，放化療為輔的治療模式，效果仍不滿意。胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)理目前尚未完全明確，普遍認(rèn)為其形成、發(fā)展是一個涉及多個基因、歷經(jīng)多個階段的過程。目前大量研究已證明，絲氨酸蛋白酶1(HTRA1)基因在子宮內(nèi)膜癌[4]、肝癌[5]、卵巢癌[6]、膠質(zhì)細(xì)胞瘤[7]等多種癌癥中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，表明HTRA1具有腫瘤抑制功能，但其在胃癌中是否亦有腫瘤抑制功能尚無報道。本研究收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院2010年1月～2011年12月有完整臨床病理資料及隨訪記錄的胃癌切除術(shù)患者石蠟包埋標(biāo)本108例份，行免疫組化檢測。另收集2017年6～12月行胃癌切除的手術(shù)標(biāo)本32例份，行RT-PCR檢測，觀察HTRA1在胃癌中的表達(dá)情況，并分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，從而探討HTRA1在胃癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院2010年1月～2011年12月有完整臨床病理資料及隨訪記錄的胃癌切除術(shù)患者石蠟包埋標(biāo)本108例份，患者男63例、女45例，年齡28～84歲，平均63.6歲。腫瘤直徑<5 cm 50例，≥5 cm 58例；低或未分化57例，中高分化51例；浸潤深度T1～233例，T3～475例；胃周淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移88例，無轉(zhuǎn)移20例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期42例，Ⅲ～Ⅳ期66例?；颊咝g(shù)前均未接受過放療或化療。無其他惡性腫瘤病史。此組標(biāo)本用于免疫組化檢測。另收集2017年6～12月行胃癌手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本32例份，每個病例均取胃癌組織及遠(yuǎn)癌組織，遠(yuǎn)癌組織指距腫瘤5 cm以外的正常胃組織。標(biāo)本切下后迅速置于-196 ℃液氮中冷凍，然后置于-80 ℃冰箱保存。此組標(biāo)本用于RT-PCR檢測。本研究得到武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 胃癌及遠(yuǎn)癌組織中HTRA1蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。分別對胃癌組織及遠(yuǎn)癌組織進(jìn)行免疫組化S-P法染色，石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，H2O2室溫孵育20 min滅活內(nèi)原性過氧化物酶，切片抗原修復(fù)后，滴加鼠抗人HTRA1一抗(1∶200稀釋)50 μL，4 ℃過夜；過夜后將切片室溫平衡1 h，加入抗鼠IgG二抗，37 ℃ 1 h；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。所有免疫組化結(jié)果由兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立讀片判斷，顯微鏡下觀察結(jié)果。結(jié)果采用半定量計分方法，在200倍高倍鏡下，隨機(jī)選擇5個腫瘤區(qū)域，無陽性細(xì)胞計0分，陽性細(xì)胞占1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，81%～l00%計4分；同時評估陽性細(xì)胞染色強(qiáng)弱：0分為無色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。兩項的乘積即為該例病變的免疫組化評分：0分為陰性(-)；1～4分為弱陽性(+)；5～8分為中度陽性(++)；9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。以大于5分判斷為陽性，5分以下為陰性。

1.3 胃癌組織中HTRA1 mRNA表達(dá)檢測 采用實時熒光定量PCR法。TRIzol法提取組織中的總RNA，作為反轉(zhuǎn)錄模板生存cDNA。HTRA1引物：正向引物5′-TTGTTTCGCAAGCTTCCGTT-3′，反向引物5′-ACGTGGGCATTTGTCACGAT-3′。β-actin作為內(nèi)參，正向引物5′-CACGGCACTGATTTTCAGTTCT-3′，反向引物5′-TTCTTGCTGCCAGTCTGGACT-3′。反應(yīng)條件：變性階段(94 ℃ 5 min)和35個循環(huán)的擴(kuò)增定量階段(94 ℃ 15 s；58 ℃ 45 s)。2ΔΔCT法計算每個腫瘤樣本對于正常對照樣本目的基因的相對Ct值差異。Ct表示目的基因的熒光值設(shè)定的閾值時反應(yīng)循環(huán)數(shù)。ΔΔCt=ΔCt(腫瘤樣本)-ΔCt(對照樣本)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。應(yīng)用配對t檢驗評估胃癌組織與遠(yuǎn)癌組織中HTRA1蛋白及mRNA表達(dá)差異，應(yīng)用χ2檢驗評估HTRA1相對表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系， Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并應(yīng)用Log-Rank檢驗評估HTRA1 mRNA表達(dá)與生存時間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HTRA1蛋白表達(dá)比較 THRA1蛋白陽性呈棕褐色顆粒，主要表達(dá)于細(xì)胞核中，HTRA1蛋白在胃癌組織中陽性表達(dá)率為17.6%(19/108)，而在遠(yuǎn)癌組織中陽性表達(dá)率為82.4%(89/108)，與遠(yuǎn)癌組織相比，胃癌組織中的HTRA1蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。

2.2 胃癌及遠(yuǎn)癌組織中HTRA1 mRNA表達(dá)比較 胃癌標(biāo)本中HTRA1 mRNA表達(dá)較遠(yuǎn)癌組織下調(diào)24例(75%)，胃癌及遠(yuǎn)癌組織中HTRA1 mRNA相對表達(dá)量分別為6.06±1.57、4.85±1.39，胃癌與遠(yuǎn)癌組織相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.002)。

2.3 THRA1蛋白表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 HTRA1蛋白表達(dá)與腫瘤大小、浸潤深度有關(guān)(P均<0.05)，HTRA1蛋白表達(dá)與腫瘤相關(guān)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度、患者年齡及性別等無關(guān)(P均>0.05)，見表1。

表1 HTRA1蛋白表達(dá)與108例胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.4 HTRA1蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 本組患者隨訪過程中有67例死亡，中位生存時間為46.8個月。其中HTRA1蛋白表達(dá)陽性與陰性患者的3年生存率分別為68.4%和50.6%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Kaplan-Meier繪制生存曲線結(jié)果顯示，HTRA1蛋白低表達(dá)者較高表達(dá)者生存時間縮短(P=0.012)，見圖1。

圖1 HTRA1蛋白陽性與陰性表達(dá)者生存曲線

3 討論

絲氨酸蛋白酶家族(HTRA)是一種具有熱休克蛋白性質(zhì)的膜蛋白酶,廣泛存在于人體的組織器官中。截止到目前，人類共發(fā)現(xiàn)四種HTRA家族同源物，即HTRA1 (Prss11, L56)、HTRA2 (Omi)、HTRA3 (PRSP)和HTRA4[8]。這些同源物均包含1個高度保守的胰酶樣蛋白酶結(jié)構(gòu)域和1個1～2碳末端盤狀同源區(qū)域[9]。盤狀同源區(qū)域是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)反應(yīng)模塊，作為多聚體信號復(fù)合物的組織者發(fā)揮重要作用[10]。被認(rèn)為是激活細(xì)菌和人類HtrA家族成員蛋白酶活性的開關(guān)[11]。

HTRA1是第一個被發(fā)現(xiàn)的人絲氨酸蛋白酶家族成員，最初是在肉毒病毒40(SV40)成纖維細(xì)胞中檢測到[11]，之后在軟骨關(guān)節(jié)炎病例中亦檢測到[12]。在哺乳動物的多種生物機(jī)制中發(fā)揮重要作用，在骨關(guān)節(jié)炎、阿爾茨海默病、黃斑變性、細(xì)胞遷移、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移及化療引起的細(xì)胞毒性中起重要作用[13]。HTRA1基因包含9個外顯子，編碼458個氨基酸，定位于染色體10q26.2。從氨基酸的氮末端到碳末端包含有信號肽(SS)、胰島素生長因子結(jié)合域(IGFBP)、Kazal型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、胰酶樣蛋白酶結(jié)構(gòu)域及盤狀同源區(qū)域等[10]。研究表明HTRA1在宮頸癌、黑色素瘤、子宮內(nèi)膜癌及肝癌等多種癌癥中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，這表明HTRA1具有腫瘤抑制功能。Chien等[14]研究發(fā)現(xiàn)，HTRA1表達(dá)敲除后能使宮頸癌細(xì)胞SKOV3獲得懸浮生長特性，而過表達(dá)HTRA1則能誘導(dǎo)另一種宮頸癌細(xì)胞OV2O2死亡。HE等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SKOV3和TOV21G宮頸癌細(xì)胞株中HTRA1表達(dá)敲除后，腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性屏障失巢凋亡被抑制。推測失巢凋亡被抑制可能與EGFR/AKT信號通路激活有關(guān)，由此其研究小組采用免疫沉淀和免疫熒光法檢測了細(xì)胞膜和細(xì)胞核內(nèi)HTRA1和EGFR相互作用情況，發(fā)現(xiàn)在懸浮培養(yǎng)基SKOV3 細(xì)胞中，HTRA1表達(dá)自動上調(diào)，而HTRA1表達(dá)上升能抑制EGFR/AKT信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加。而采用蛋白酶水解能力喪失突變型HTRA1轉(zhuǎn)染SKOV3 細(xì)胞后，則不能檢測到EGFR/AKT信號通路被抑制或細(xì)胞死亡率升高。因此推測HTRA1主要通過抑制EGFR/AKT信號通路使其具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移能力[15]。

本研究通過免疫組化和RT-PCR實驗方法，分別在蛋白和基因?qū)用孀C實胃癌組織中HTRA1表達(dá)低于遠(yuǎn)癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與其在宮頸癌、肝癌等中的研究基本一致。結(jié)合臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，HTRA1表達(dá)與腫瘤大小、浸潤深度有關(guān)，HTRA1低表達(dá)的患者，腫瘤生長更大，浸潤更深。并在生存分析中發(fā)現(xiàn)，HTRA1基因低表達(dá)患者預(yù)后差。提示HTRA1是一種抑制胃癌生長的基因。但其在胃癌中如何發(fā)揮抑制腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移尚需進(jìn)一步研究。