李 丹，王一迪，蔡新華，陳敬芝，呂玉珠，梁乾坤

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院2013級(jí)本科，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003)

阿霉素屬蒽環(huán)類(lèi)抗生素，廣泛用于骨肉瘤等腫瘤的治療，可引起多種不良反應(yīng)，其中以心臟毒性危害最大[1-2]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子1 (signal transducers and activators of transcription 1，STAT1)是STAT家族成員，STAT蛋白介導(dǎo)多個(gè)信號(hào)通路，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖分化、凋亡等病理生理過(guò)程[3]。刺梨黃酮是刺梨果實(shí)中提取的黃酮類(lèi)生物活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[4-5]。本研究采用阿霉素誘導(dǎo)大鼠來(lái)建立心力衰竭模型，并給予刺梨黃酮干預(yù)，探討刺梨黃酮對(duì)阿霉素所致心肌損傷的保護(hù)作用及其對(duì)心室肌中STAT1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雌性Sprague Dawley大鼠24只(由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量140～200 g，給予專(zhuān)用飼料和蒸餾水，分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食水，每2 d換1次墊料。

1.2主要試劑與儀器注射用鹽酸阿霉素(美國(guó)輝瑞公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20130186)，刺梨黃酮(第四軍醫(yī)大學(xué)徐萍博士提供，專(zhuān)利號(hào)：ZL201010570876.1)，生物素-鏈霉卵白素免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，羊抗兔異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)、羊抗兔Cy3 (美國(guó)Invitrogen公司)，兔抗大鼠factor Ⅷ因子多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，羊抗兔STAT1抗體(美國(guó)Santa Craz公司)，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(上海碧云天生物技術(shù)研究所)。免疫組織化學(xué)孵育箱(浙江余姚儀器廠)，H7500透射電子顯微鏡(日本日立公司)，CM 1850冰凍切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)，Vevo 2100 成像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司)，激光掃描共焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及各組大鼠干預(yù)措施將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)、模型組(n=9)和刺梨黃酮組(n=9)。模型組和刺梨黃酮組大鼠腹腔注射 0.5 g·L-1的鹽酸阿霉素溶液(2 mL·kg-1)制備心力衰竭模型，每日1次，共10 d；空白對(duì)照組大鼠僅腹腔注射等量的生理鹽水，共10 d。造模的同時(shí)，刺梨黃酮組大鼠于每次注射阿霉素后給予 0.1 g·L-1刺梨黃酮溶液灌胃(2 mL·kg-1)，每日1次，共 10 d；模型組和對(duì)照組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，共10 d。

1.3.2動(dòng)物一般體征觀察觀察各組大鼠飲食、活動(dòng)、精神狀況、皮毛變化、體質(zhì)量等。

1.3.3心臟超聲檢查各組大鼠心功能大鼠完成刺梨黃酮灌胃后次日進(jìn)行超聲評(píng)估，以左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fractions，LVEF)<45% 作為心力衰竭評(píng)估的主要參數(shù)。大鼠麻醉后仰臥位于平臺(tái)上固定四肢，脫去胸部毛發(fā)，利用Vevo?2100成像系統(tǒng)對(duì)大鼠心臟進(jìn)行掃查，掃查深度為2.0～3.0 cm，分別以大鼠心電圖的QRS波群和t波作為收縮期和舒張期的標(biāo)志，并結(jié)合圖像上二尖瓣的開(kāi)閉，測(cè)量各組大鼠EF、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)和左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)。

1.3.4標(biāo)本采集心臟超聲檢測(cè)后，處死大鼠，迅速開(kāi)胸取大鼠心臟，剪除心尖及周?chē)笱芎徒Y(jié)締組織，暴露心腔，以生理鹽水沖洗后將心室肌組織分為2份，1份置于預(yù)冷蠟板上，滴加預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液，使用雙面刀片沿冠狀溝下約 1 mm 做水平切，取約1 mm×1 mm×1 mm心室肌組織塊，迅速置于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液中，應(yīng)用透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)。另1份置于40 g·L-1多聚甲醛中固定8 h，置于150、300 g·L-1蔗糖溶液中梯度脫水，待組織塊沉液面以下后，取出組織塊，濾紙吸干，置于4 ℃冰箱保存待用。

1.3.5透射電鏡觀察各組大鼠心室肌超微結(jié)構(gòu)心肌組織塊常規(guī)電鏡技術(shù)方法進(jìn)行包埋，超薄切片，透射電鏡下觀察心室肌超微結(jié)構(gòu)并采集圖像。

1.3.6蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色觀察大鼠心肌組織病理學(xué)改變制備切片標(biāo)本時(shí)，采用鳥(niǎo)氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(optimal cutting temperature，OCT)包埋，于-20 ℃冰凍切片機(jī)制備標(biāo)本，片厚6 μm，切片置于37 ℃溫箱烤片40 min，置于低溫冰柜中保存待用，切片標(biāo)本復(fù)溫，蘇木精染色7 min，自來(lái)水返藍(lán)2 min，伊紅染色40 s，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察并采集圖片。

1.3.7免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠心肌組織中STAT1蛋白表達(dá)切片標(biāo)本復(fù)溫，體積分?jǐn)?shù)0.3%過(guò)氧化氫37 ℃孵育10 min，漂洗3次，每次5 min；加入羊抗兔STAT1抗體(應(yīng)用50 g·L-1牛血清白蛋白1200稀釋)，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，其他步驟按照生物素-鏈霉卵白素免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，二氨基聯(lián)苯胺顯色，室溫孵育6 min。常規(guī)脫水、透明中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察并采集圖片，利用Image J圖像分析系統(tǒng)對(duì)STAT1蛋白進(jìn)行定量分析。

1.3.8免疫熒光雙標(biāo)染色觀察模型組大鼠心室肌中STAT1蛋白與factorⅧ蛋白表達(dá)部位切片復(fù)溫、水化，100 g·L-1脫脂奶粉溶液室溫封閉30 min后加入兔抗大鼠factor Ⅷ因子多克隆抗體(應(yīng)用 50 g·L-1牛血清白蛋白1100稀釋)，置于 4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；加入羊抗兔FITC(應(yīng)用100 g·L-1脫脂奶粉溶液11 000 稀釋)，室溫孵育60 min (避光)，漂洗3次，每次5 min；加入STAT1于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，加入羊抗兔Cy3(應(yīng)用100 g·L-1脫脂奶粉溶液11 000 稀釋)，室溫孵育60 min (避光)，漂洗3次，每次5 min；加入DAPI室溫孵育 10 min，漂洗3次，每次5 min?？勾銣绶馄瑒┓馄?，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并采集圖片。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般體征變化對(duì)照組大鼠飲食正常，體質(zhì)量略有增加，皮毛光滑，活動(dòng)力強(qiáng)。模型組2只大鼠在給藥后第2天出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，第4天出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，表現(xiàn)為飲食量減少、體質(zhì)量下降、毛發(fā)凌亂、腹部脫毛、眼瞼分泌物增多、呼吸頻率加快、活動(dòng)量減少、喜聚團(tuán)，第7天所有大鼠出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，體質(zhì)量嚴(yán)重下降，第9天死亡1只，第10天死亡3只，共死亡4只。刺梨黃酮組大鼠中毒現(xiàn)象及體質(zhì)量下降情況較模型組輕，整體飲食量略有減少、體質(zhì)量稍下降，其中3只大鼠在給藥后第8天出現(xiàn)毛發(fā)凌亂、聚團(tuán)現(xiàn)象，在給藥第10天死亡，1只大鼠在給藥結(jié)束后做心功能檢測(cè)時(shí)死亡，共死亡4只。

2.2各組大鼠心功能比較結(jié)果見(jiàn)表1。模型組大鼠LVEF低于對(duì)照組，LVESD和LVEDD高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；刺梨黃酮組大鼠LVEF高于模型組，LVESD和LVEDD低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表13組大鼠心功能比較

組別nLVEF/%LVESD/mmLVEDD/mm對(duì)照組675.81±1.583.78±0.376.04±0.26模型組541.14±1.77a4.83±0.13a7.21±0.25a刺梨黃酮組559.48±2.61b4.27±0.22b6.57±0.12b

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

2.3各組大鼠心室肌超微結(jié)構(gòu)結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)照組大鼠心室肌線粒體結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維排列整齊，細(xì)胞核規(guī)則。模型組大鼠心室肌纖維出現(xiàn)退行性改變，表現(xiàn)為肌絲排列紊亂，出現(xiàn)明顯的收縮帶，Z線增粗，排列不規(guī)則；線粒體及細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)出現(xiàn)局灶性溶解，并發(fā)生“鞘樣”改變；細(xì)胞核發(fā)生棘突樣改變，肌細(xì)胞表面出現(xiàn)大小不一的“指狀突起”。刺梨黃酮組心室肌狀態(tài)明顯改善，肌纖維排列較整齊，收縮帶不明顯，細(xì)胞核規(guī)則。對(duì)照組大鼠心室肌間質(zhì)、毛細(xì)血管均正常，內(nèi)皮細(xì)胞可見(jiàn)少量吞飲胞；模型組大鼠與對(duì)照組相比心室肌間質(zhì)出現(xiàn)水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯，內(nèi)皮細(xì)胞呈波浪狀，內(nèi)皮細(xì)胞吞飲泡明顯增多；刺梨黃酮組大鼠心室肌間質(zhì)情況較模型組有所改善。

A～C：心室肌；D～F：心肌間質(zhì)。

圖1各組大鼠心室肌組織結(jié)構(gòu)(透射電鏡，×10000)

Fig.1Structuresofcardiacventricleofratsineachgroup(transmissionelectronmicroscope，×10000)

2.4各組大鼠心室肌組織病理學(xué)改變對(duì)照組大鼠心肌纖維排列整齊，無(wú)斷裂，心肌細(xì)胞完整，排列整齊，細(xì)胞間隙均勻，未見(jiàn)異常改變。模型組大鼠心肌紊亂呈波浪狀，肌束內(nèi)細(xì)胞密集，心肌間隙明顯增寬，某些區(qū)域存在心肌細(xì)胞水腫、肌原纖維溶解和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分毛細(xì)血管擴(kuò)張。刺梨黃酮組大鼠心肌纖維排列稍紊亂，肌原纖維溶解不明顯(圖2)。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：刺梨黃酮組。

圖2各組大鼠心室肌組織結(jié)構(gòu)(HE染色，×400)

Fig.2Structuresofcardiacventricleofratsineachgroup(HEstaining，×400)

2.5各組大鼠心室肌組織中STAT1蛋白表達(dá)量STAT1蛋白在心室肌中呈陽(yáng)性表達(dá)，主要在心室肌細(xì)胞周邊部呈棕黃色沉淀，陽(yáng)性結(jié)果呈線樣或點(diǎn)樣(圖3)。對(duì)照組、模型組和刺梨黃酮組大鼠心室肌中STAT1蛋白的表達(dá)量分別為0.27±0.02、0.56±0.07和0.32±0.03。模型組大鼠心室肌中STAT1蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；刺梨黃酮組大鼠心室肌中STAT1蛋白表達(dá)量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：刺梨黃酮組。

圖3各組大鼠心室肌組織中STAT1蛋白表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

Fig.3ExpressionofSTAT1inventricularmyocytesofratsineachgroup(immunohistochemistrystaining，×400)

2.6各組大鼠心室肌中STAT1蛋白與factorⅧ蛋白表達(dá)部位結(jié)果顯示，STAT1與 factor Ⅷ存在共表達(dá)(圖4)。

A：DAPI示細(xì)胞核； B：綠色熒光示Factor Ⅷ陽(yáng)性；C：紅色熒光示STAT1陽(yáng)性；D：ABC疊加。

圖4模型組大鼠心室肌中STAT1與factorⅧ蛋白共表達(dá)結(jié)果(免疫熒光染色，×400)

Fig.4CoexpressionresultofSTAT1andfactorⅧproteininventricularmyocytesofratsinmodelgroup(immunofluorescencestaining，×400)

3 討論

阿霉素是臨床廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物[6]，有嚴(yán)重的心臟毒性，本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射0.5 g·L-1鹽酸阿霉素溶液(2 mL·kg-1)制備心力衰竭大鼠模型，動(dòng)物超聲評(píng)估顯示心力衰竭大鼠模型制備成功。

刺梨是分布于我國(guó)西北地區(qū)的野生植物，有消食健脾、滋補(bǔ)健身的功效，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[7]。研究發(fā)現(xiàn)，刺梨黃酮可以通過(guò)Bcl-2/Caspase-3信號(hào)途徑發(fā)揮保護(hù)作用，提高脾臟的造血功能[8-9]。本研究結(jié)果顯示，刺梨黃酮組大鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)較模型組顯著改善，心室肌STAT1蛋白表達(dá)量較模型組明顯降低，提示刺梨黃酮可有效改善心力衰竭大鼠的心功能，并對(duì)阿霉素引起的心肌損傷有明顯的保護(hù)作用。刺梨黃酮組大鼠生存質(zhì)量較模型組有顯著提高，但死亡數(shù)量相同，表明本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中刺梨黃酮雖不能降低大鼠死亡率，但可提高動(dòng)物生存質(zhì)量。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子水平升高程度與心力衰竭大鼠的臨床癥狀嚴(yán)重程度有關(guān)，而心力衰竭的基本機(jī)制是心肌重塑與細(xì)胞凋亡，其發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體生物活性分子過(guò)度表達(dá)有關(guān)[10]。有學(xué)者研究了STAT1和STAT3在缺血性心臟病中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STAT3對(duì)心臟主要起保護(hù)作用，而STAT1的作用主要表現(xiàn)在促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡及減少心肌自噬性保護(hù)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)大鼠心室肌中STAT1蛋白與factor Ⅷ表達(dá)，發(fā)現(xiàn)STAT1蛋白與factor Ⅷ存在共表達(dá)，factor Ⅷ是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白[13]，因此推測(cè)，STAT1主要參與心室肌內(nèi)皮細(xì)胞的變化，黃酮可能通過(guò)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)發(fā)揮其保護(hù)作用，刺梨黃酮對(duì)心肌的保護(hù)作用只能減輕心肌細(xì)胞的損傷程度，但尚不能完全逆轉(zhuǎn)阿霉素所致的損傷。本實(shí)驗(yàn)揭示了刺梨黃酮在體內(nèi)對(duì)抗阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的途徑，為進(jìn)一步研究STAT1在阿霉素所致心肌損傷中的表達(dá)情況及深入探討刺梨黃酮對(duì)阿霉素所致心肌損傷的保護(hù)作用的具體機(jī)制提供了新的科研思路，為今后的靶基因治療提供理論依據(jù)。