郭會(huì)敏，范毛川，華方方，楊勝華，楊 君

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，河南 衛(wèi)輝 453100)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康和生活質(zhì)量[1]。近年來，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡也向年輕化發(fā)展[2]。子宮內(nèi)膜癌傳統(tǒng)的治療方法主要有手術(shù)治療、化學(xué)治療和放射治療，這些治療方法均存在諸多缺陷[3]。因此，探索子宮內(nèi)膜癌新的治療方法至關(guān)重要。隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從基因、蛋白乃至分子水平上對(duì)子宮內(nèi)膜癌進(jìn)行聯(lián)合治療具有較大的潛力。目前，針對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白進(jìn)行腫瘤靶向治療是一個(gè)新的研究方向[4]。脂聯(lián)素是重要的腫瘤特異性蛋白之一，屬于細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，在抗腫瘤中發(fā)揮作用。脂聯(lián)素表達(dá)水平高的腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力較低[5]。由此推測，脂聯(lián)素可能在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮調(diào)控作用。但是，脂聯(lián)素是否參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移目前尚不清楚。本研究旨在探討脂聯(lián)素對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制，以期為子宮內(nèi)膜癌的臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、試劑與儀器子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞購自上海拜力生物科技有限公司，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體購自北京鼎國生物工程有限公司，磷脂酰絲氨酸外翻檢測試劑盒、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V-FITC)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、caspase-3活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，抗脂聯(lián)素抗體和二抗購自美國Sigma公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自上海豐壽生物科技有限公司，脂聯(lián)素反義RNA及其對(duì)照microRNA由蘇州吉瑪基因股份有限公司構(gòu)建和提供。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermofisher公司，BD Accuri C6流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；ChemiDocTMTouch Imaging System購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞復(fù)蘇后應(yīng)用含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，呈貼壁生長，1～2 d換液1次，2.5 g·L-1胰蛋白酶常規(guī)消化，13傳代。將培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染取3組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前1 d使用0.1 nmol·L-1胰蛋白酶和二胺四乙酸混合物于37 ℃下消化10 min，加入新鮮培養(yǎng)基，1 000 r·min-1離心5 min，細(xì)胞沉淀重懸于新鮮的含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。第2天，細(xì)胞密度達(dá)到約95%，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將脂聯(lián)素反義RNA(50 nmol·L-1)及其對(duì)照microRNA(50 nmol·L-1)分別轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后換新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3MTT法檢測子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖能力細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，收集3組對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100 μL(96孔平底板)，鋪板使待測細(xì)胞密度為每孔1 000個(gè)，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況；每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液；每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀波長490 nm處測各孔的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.4磷脂酰絲氨酸外翻流式細(xì)胞術(shù)檢測子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞凋亡情況細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，取3組Ishikawa細(xì)胞各2×105個(gè)，向250 μL細(xì)胞懸液中分別加入50 μL的Annexin V FITC試劑和1 μL反應(yīng)緩沖液，常溫下避光孵育20 min。采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況，以磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞膜表面的表達(dá)量作為凋亡指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)檢測中發(fā)射光波長和吸收光波長分別為484、625 nm，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.5子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中caspase-3活性檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，取3組Ishikawa細(xì)胞各2×105個(gè)，向細(xì)胞中加入裂解液，使細(xì)胞中蛋白質(zhì)釋放出來，再向細(xì)胞裂解物中加入caspase-3生色底物，常溫下避光孵育20 min。酶標(biāo)儀分析各組細(xì)胞在波長492 nm處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.6Westernblot法檢測子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中脂聯(lián)素及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK)表達(dá)水平細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，取3組Ishikawa細(xì)胞各2×105個(gè)，向細(xì)胞懸液中加入裂解液，充分裂解細(xì)胞，再向細(xì)胞裂解物中加入電泳上樣緩沖液，制備western blot樣品。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)細(xì)胞中的蛋白水平進(jìn)行分析。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳條件如下：先在60 V下電泳30 min，再在60 V下電泳100 min；將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)移條件為90 mA、180 min；將硝酸纖維素膜浸泡于含50 g·L-1脫脂奶粉和吐溫-20的磷酸鹽緩沖液中，室溫下輕輕搖動(dòng)封閉2 h；使用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌2次。在硝酸纖維素膜上分別加入抗脂聯(lián)素(12 000)的單克隆抗體或抗actin的內(nèi)參單克隆抗體(14 000)，室溫條件下反應(yīng) 3 h，使用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌2次。再向硝酸纖維素膜上加入山羊抗小鼠二抗(11 000)，室溫條件下反應(yīng)3 h；使用含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液洗滌2次。最后，對(duì)硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行顯影和定影，采用Image J 6.0軟件處理和分析各組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中ERK蛋白和脂聯(lián)素的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.7克隆形成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，取3組Ishikawa細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106L-1，按照0、10、50、100、200倍的梯度進(jìn)行稀釋，將稀釋后的細(xì)胞接種至軟瓊脂中，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。待有克隆形成時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入純甲醇室溫下固定15 min。加入Giemsa染色30 min，進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.8Transwell實(shí)驗(yàn)檢測子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞遷移能力細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后，取3組Ishikawa細(xì)胞，在Transwell板上層鋪固體培養(yǎng)基，下層鋪含有趨化因子的培養(yǎng)基，上層分別接種3組Ishikawa細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)下層細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.13組Ishikawa細(xì)胞增殖能力比較空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞增殖能力(灰度值)分別為49.2±11.1、52.3±12.3、85.0±18.1；實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞增殖能力大于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.745、5.266，P<0.01)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組Ishikawa細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.479，P>0.05)。

2.23組Ishikawa細(xì)胞凋亡情況比較空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸表達(dá)分別為6.8±1.3、7.4±1.6，4.2±0.9；實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸表達(dá)低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.477、5.510，P<0.05)，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組Ishikawa細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=1.033，P>0.05)；見圖1?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞中caspase-3活性分別為3.6±1.1、3.8±1.2、1.1±0.1；實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞中caspase-3活性低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=6.085、6.562，P<0.01)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組Ishikawa細(xì)胞中caspase-3活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.477，P>0.05)。

圖13組Ishikawa細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸的表達(dá)

Fig.1ExpressionofphosphatidylserineofonthesurfaceofIshikawacellmembraneinthethreegroups

2.33組Ishikawa細(xì)胞中脂聯(lián)素及ERK蛋白表達(dá)比較空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞中脂聯(lián)素蛋白表達(dá)分別為3.50±0.01、3.41±0.01、1.32±0.01；實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞中脂聯(lián)素蛋白表達(dá)低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=69.803、66.630，P<0.01)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組Ishikawa細(xì)胞中脂聯(lián)素蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.173，P>0.05)；見圖2?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞中ERK蛋白表達(dá)分別為1.1±0.1、1.2±0.1、1.4±0.1；實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞中ERK蛋白表達(dá)低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=7.423、4.949，P<0.01)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組Ishikawa細(xì)胞中ERK蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=2.474，P>0.05)；見圖3。

圖23組Ishikawa細(xì)胞中脂聯(lián)素蛋白表達(dá)

Fig.2ExpressionofadiponectinproteininIshikawacellsinthethreegroups

圖33組Ishikawa細(xì)胞中ERK蛋白表達(dá)

Fig.3ExpressionofERKproteininIshikawacellsinthethreegroups

2.43組Ishikawa細(xì)胞克隆能力比較結(jié)果見圖4?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞克隆數(shù)分別為101.3±23.1、109.1±25.4、236.3±41.2；實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞克隆能力大于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=9.819、9.238，P<0.05)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組Ishikawa細(xì)胞克隆能力能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.582，P>0.05)。

圖43組Ishikawa細(xì)胞克隆能力(×20)

Fig.4CloningabilityofIshikawacellsinthethreegroups(×20)

2.53組Ishikawa細(xì)胞侵襲能力比較結(jié)果見圖5?？瞻讓?duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)分別為90.1±13.2、89.3±14.3、486.2±69.1。實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞侵襲能力大于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=21.422、21.476，P<0.01)；空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組Ishikawa細(xì)胞侵襲能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.054，P>0.05)。

圖53組Ishikawa細(xì)胞侵襲能力(×20)

Fig.5InvasivenessofIshikawacellsinthethreegroups(×20)

3 討論

脂聯(lián)素是由apM1基因編碼的一種脂源性膠原樣蛋白，主要存在于血液中，正常情況下血漿脂聯(lián)素水平為1.9～17.0 mg·L-1，人類apM1基因是單拷貝基因，位于染色體3q27，全長約16 kb，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，有6種存在方式，不同形式的脂聯(lián)素與其受體結(jié)合后發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。脂聯(lián)素在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不十分清楚，有研究表明，脂聯(lián)素是重要的腫瘤特異性蛋白之一，它是細(xì)胞凋亡的促進(jìn)蛋白，發(fā)揮重要的抗腫瘤作用。脂聯(lián)素高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力差[5-9]。PETRIDOU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，<65歲女性血清脂聯(lián)素水平每增加1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，其患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)就降低50%。CUST等[11]和MA等[12]研究發(fā)現(xiàn)，血清脂聯(lián)素水平與子宮內(nèi)膜癌呈負(fù)相關(guān)。目前，脂聯(lián)素在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制仍不明確[13-15]。惡性增生和轉(zhuǎn)移侵襲能力是腫瘤細(xì)胞的重要特征，它是一個(gè)主動(dòng)過程，主要涉及腫瘤細(xì)胞、宿主細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)之間一系列復(fù)雜的相互作用，癌細(xì)胞與細(xì)胞外間質(zhì)的黏附、細(xì)胞外間質(zhì)和基底膜的降解及癌細(xì)胞的移動(dòng)常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。本研究以子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞為細(xì)胞模型，采用靶向脂聯(lián)素的反義RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)探討了脂聯(lián)素對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Ishikawa細(xì)胞增殖能力大于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組Ishikawa細(xì)胞增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，克隆形成實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用脂聯(lián)素反義RNA敲減子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中脂聯(lián)素的表達(dá)水平后，子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的克隆形成能力及細(xì)胞的遷移能力明顯增強(qiáng)；說明轉(zhuǎn)染脂聯(lián)素反義RNA的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的生長和侵襲能力更強(qiáng)，提示脂聯(lián)素具有抑制腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的作用。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體的一種生理過程，機(jī)體在產(chǎn)生新生細(xì)胞的同時(shí)，衰老和突變的細(xì)胞通過凋亡機(jī)制被清除，使器官和組織得以正常發(fā)育和代謝。細(xì)胞凋亡的調(diào)控障礙與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，腫瘤的發(fā)生與控制細(xì)胞增殖的癌基因的過度表達(dá)有關(guān)，也與抑制細(xì)胞凋亡的基因高表達(dá)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的抗癌基因變異失活有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染脂聯(lián)素反義RNA的Ishikawa細(xì)胞中caspase-3活性及細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸表達(dá)降低，說明轉(zhuǎn)染脂聯(lián)素反義RNA的Ishikawa細(xì)胞凋亡減少，提示脂聯(lián)素可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長。這與以往研究[16-17]結(jié)果一致。

ERK是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是傳遞絲裂原信號(hào)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的增殖、分化和存活，ERK和其信號(hào)途徑在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起中介和放大信號(hào)的作用。有研究表明，脂聯(lián)素受體在人類子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞及上皮細(xì)胞中均有表達(dá)[18]，脂聯(lián)素通過與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞上的脂聯(lián)素受體結(jié)合，增加腺苷一磷酸依賴的蛋白激酶(5′-adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)a亞基的磷酸化而激活A(yù)MPK來調(diào)節(jié)不同細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和E2(Cyclin E2)以及信號(hào)蛋白ERK1/2和蛋白激酶B，上調(diào)抑癌基因 肝激酶B1表達(dá)來抗腫瘤增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用脂聯(lián)素反義RNA敲低子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中脂聯(lián)素水平后引起了ERK蛋白表達(dá)升高，提示脂聯(lián)素可能通過抑制ERK蛋白表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化與存活。

綜上所述，脂聯(lián)素可能通過誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡及抑制子宮內(nèi)膜癌遷移和侵襲雙重作用發(fā)揮抗腫瘤作用。但是，脂聯(lián)素在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制仍不明確，有待于進(jìn)一步研究。