馬俊 李博 王麗萍 許鳴

胃癌是世界范圍內(nèi)難治性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率位居各惡性腫瘤前列[1-3]?；瘜W治療是胃癌的主要治療方法，氟尿嘧啶作為胃癌化學治療的一線藥物，治療劑量和中毒劑量較接近，使其應用受到一定的限制[4]。因此，探索如何提高化學治療藥物的療效、減少其不良反應，成為近年研究的熱點。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)過度表達的微小RNA-345(miR-345)提示胃癌患者的術后生存期更短[5]。沉默miR-345表達可引起細胞周期進程的停滯而減慢細胞生長速度。本研究在前期研究基礎上沉默胃癌細胞中miR-345的表達后，觀察胃癌細胞在氟尿嘧啶作用下細胞生長速度、侵襲能力等變化情況，為增加胃癌化學治療敏感性尋找到新的作用靶點，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、材 料

胃癌MGC803細胞購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；胎牛血清購自吉泰生物公司；Trizol購自 Invitrogen公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；miR-345的 逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR引物由Invitrigen公司設計、合成；實時定量PCR檢測試劑盒購自Roche公司；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自Sigma公司。Transwell小室購自Corning公司。

二、方 法

1.細胞的培養(yǎng)

胃癌MGC803細胞在5%CO2、37 ℃飽和濕度條件，于10%胎牛血清(Hyclone)的改良型RPMI1640下培養(yǎng)，每2～3 d胰酶消化并傳代1次。

2.反義miR-345寡核苷酸的設計合成及轉(zhuǎn)染

從miR靶基因庫(http://microrna. sanger. ac. uk/targets/v3)獲得miR-345基因序列，設計并合成甲基化miR-345反義序列5’-UTCAATGTUG-AATCCAGCAUAAGCUAGAGUCC-3’，無義序列5’-UCUACUCUUAGGAGGUUGUUGATGCA-3’。將細胞接種于培養(yǎng)板，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染，在5 min內(nèi)同稀釋的寡核苷酸序列混合，將復合物加入到細胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

3.miR-345表達水平的實時定量PCR檢測

miR-345反向引物5’-TATGCTGCTCGGGACCTGATCCTCA-3’，正向引物5’-GTCGTATCCAGTGCA-GGGTCCGAGG-3’，內(nèi)參U6反向引物5’-ACAGTA-GGAACGCGTCCCCGGTACG-3’，正向引物5’-GCA-GGGTCCGAGGTATTCGCACTGG-3’。反應體系：2份實時定量PCR混合液10 μl，正反向引物(4 μmol/L)各1 μl，雙蒸水補足體積至20 μl。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，65 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。所得結(jié)果采用目的基因與內(nèi)參基因CT值比較后的數(shù)值(△CT)。

4.細胞增殖能力的MTT 檢測

收集對數(shù)生長期MGC803細胞，以5×103/孔接種細胞于培養(yǎng)板中，每孔100 μl，實驗設3組：空白對照組(不轉(zhuǎn)染)、無義序列組(轉(zhuǎn)染miR-345無義序列)、as-miR-345 組(轉(zhuǎn)染miR-345反義序列)，各組又設6個氟尿嘧啶濃度：0、10、20、40、80、160 μg/ml，每組均設3個復孔，加藥處理48 h后，加入20 μl MTT 溶液，孵育4 h，加入150 μl 二甲亞砜震蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 波長處測吸光度；細胞生長抑制率(IR)=(對照組吸光度值-加藥組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%，IR>70%、51%～70%、31%～50%、≤30%分別對應細胞對藥物高度敏感、中度敏感、低度敏感、耐藥。

5.Transwell-matrigel體外侵襲試驗

Matrigel膠與無血清培養(yǎng)液按1∶3比例稀釋，取50 μl鋪于Transwell上室中，用無血清培養(yǎng)液重懸MGC803細胞并種入Transwell上室中(每室1×106/μl)，下室中加入完全培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h后取出Transwell小室，用棉棒擦凈聚碳酸濾膜上的Matrigel 膠，得到小室下面的聚碳酸濾膜，加入多聚甲醛500 μl 固定穿過濾膜的細胞，后風干、結(jié)晶紫染色15 min，熒光顯微鏡下隨機取每孔周圍和中間5個視野拍照，計數(shù)并取平均值。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染miR-345反義序列后的MGC803細胞變化

熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染后的MGC803細胞帶有綠色熒光，說明細胞轉(zhuǎn)染成功(脂質(zhì)體攜帶綠色熒光蛋白基因，其在熒光顯微鏡下可發(fā)出具有特征性的綠色熒光)，見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染miR-345反義序列后的MGC803細胞(熒光顯微鏡，×100)

二、轉(zhuǎn)染反義序列對MGC803細胞miR-345 mRNA表達水平的影響

3組的miR-345 mRNA表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義(F=43.205，P< 0.001)。其中空白對照組與無義序列組中miR-345 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，as-miR-345 組細胞miR-345 mRNA表達水平低于無義序列組及空白對照組(P均< 0.01)，說明轉(zhuǎn)染miR-345反義序列可下調(diào)MGC803細胞中miR-345 mRNA表達水平，見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)染反義序列對MGC803細胞miR-345 mRNA表達水平的影響

三、沉默miR-345表達聯(lián)合氟尿嘧啶對MGC803細胞增殖能力的影響

空白對照組中，伴隨氟尿嘧啶濃度增加，MGC803細胞IR亦有所增加；在0～80 μg/ml時，同一氟尿嘧啶濃度下as-miR-345組的細胞IR均高于空白對照組和無義序列組，表明氟尿嘧啶聯(lián)合沉默miR-345表達的作用大于氟尿嘧啶的單獨作用；as-miR-345組在40 μg/ml時已達高度敏感，而無義序列組和空白對照組對濃度<40 μg/ml的氟尿嘧啶耐藥，說明沉默miR-345表達可增加MGC803對氟尿嘧啶的敏感性，見圖3。因此選用氟尿嘧啶40 μg/ml進行Transwell-matrigel體外侵襲試驗。

圖3 沉默miR-345聯(lián)合氟尿嘧啶對MGC803細胞增殖能力的影響

四、沉默miR-345聯(lián)合氟尿嘧啶對MGC803侵襲能力的影響

as-miR-345 組、無義序列組+氟尿嘧啶組、空白對照組+氟尿嘧啶組的穿膜細胞數(shù)少于空白對照組(總體比較F=40.502、P<0.001，組間兩兩比較P均<0.05)，說明氟尿嘧啶或沉默miR-345表達均能抑制MGC803的侵襲能力；as-miR-345+氟尿嘧啶組穿膜細胞數(shù)少于as-miR-345組、空白對照+氟尿嘧啶組(總體比較F=35.832、P<0.001，組間兩兩比較P均<0.05)，說明沉默miR-345聯(lián)合氟尿嘧啶對細胞的侵襲能力抑制效果更顯著，見圖4。

討 論

氟尿嘧啶作為胃癌化學治療的一線藥物，其抗腫瘤機制主要是抗代謝，是細胞周期特異性抗惡性腫瘤藥物[6-7]。氟尿嘧啶的抗瘤范圍較廣，但其不良反應也較多，治療劑量和中毒劑量較接近，使其應用受到一定的限制。如何提高氟尿嘧啶化學治療的效果、減少其不良反應，對于胃癌的治療具有重要的意義。

筆者前期研究顯示，miR-345的表達與胃癌的TNM分期密切相關。過度表達的miR-345預示患者的術后生存期更短[8]。據(jù)此推測，降低miR-345的表達可能是增加胃癌細胞對氟尿嘧啶化學敏感性的新策略。因此，本研究沉默miR-345表達后，觀察胃癌細胞對氟尿嘧啶的藥物敏感性變化，為將來進一步研究miR-345參與提高氟尿嘧啶對化學治療敏感性研究提供基礎。

圖4 沉默miR-345聯(lián)合氟尿嘧啶對MGC803侵襲能力的影響(蘇木素-伊紅染色,×100)

本研究將miR-345反義序列轉(zhuǎn)染至MGC803胃癌細胞，下調(diào)胃癌細胞中miR-345表達。為探索沉默miR-345表達聯(lián)合氟尿嘧啶對MGC803細胞生物學行為的作用，研究設置0、10、20、40、80、160 μg/ml的氟尿嘧啶濃度，結(jié)果顯示10～160 μg/ml氟尿嘧啶聯(lián)合miR-345沉默均可抑制MGC803細胞增殖，且有協(xié)同作用，當氟尿嘧啶濃度為40 μg/ml時協(xié)同作用最為明顯，說明沉默miR-345表達能增加MGC803對氟尿嘧啶的化學治療敏感性。隨后的Transwell-matrigel體外侵襲試驗結(jié)果進一步提示，沉默miR-345表達聯(lián)合氟尿嘧啶比單獨處理對MGC803的體外侵襲能力抑制更明顯。本研究表明，沉默miR-345在MGC803細胞中的表達，在一定程度上加強了胃癌細胞對氟尿嘧啶的敏感性，其機制可能是沉默miR-345的表達能夠阻滯胃癌細胞從G1期向S期的進程，引起細胞周期進程的停滯而減慢細胞生長速度。日后課題組將觀察沉默miR-345表達聯(lián)合氟尿嘧啶對MGC803細胞凋亡周期、遷移能力等生物學行為的影響，為進一步探討基因靶向沉默聯(lián)合化學治療藥物治療胃癌及化學治療增敏提供實驗依據(jù)。