朱恒梅 祝勝郎 陳結(jié)慧 楊蕓 李金艷

糖尿病腎病(DN)是一種以腎小球系膜增寬及小球硬化為特征的疾病，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一[1]。組織型纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物-1(tPA/PAI-1)是主要的纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)，不僅能直接降解細(xì)胞外基質(zhì)，還能激活金屬蛋白酶間接降解細(xì)胞外基質(zhì)，在糖尿病腎小球硬化中發(fā)揮重要作用[2]。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)是一類能選擇性識(shí)別并結(jié)合DNA缺口的DNA結(jié)合蛋白酶[3-5]。筆者前期研究顯示，高糖可通過(guò)過(guò)度激活PARP誘導(dǎo)tPA/PAI-1功能紊亂，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)增生，提示其在糖尿病病程中可能發(fā)揮重要作用[6-8]。微小核糖核酸(miR)是一類高度保守的非編碼單鏈RNA分子，約由22個(gè)核苷酸組成，能與靶基因3’-非編碼區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致靶mRNA降解和翻譯阻遏。既往研究顯示，多種miR在糖尿病中異常表達(dá)[9-12]。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-222是重要的腫瘤相關(guān)基因，調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、增殖及侵襲[13]。近期有研究表明，miR-222可能參與糖尿病的發(fā)生[14-15]。Neijenhuis等[16]報(bào)道，hsa-miR-222能增強(qiáng)PARP-1抑制劑對(duì)癌細(xì)胞PARP-1的敏感性。因此，本研究以人腎臟系膜細(xì)胞(HMC)作為研究對(duì)象，探討miR-222在高糖致tPA/PAI-1紊亂中對(duì)PARP-1的調(diào)控作用。

材料與方法

一、 材 料

人HMC由吳斯佳碩士惠贈(zèng)。D-Glucose購(gòu)自Sigma公司，miR-222模擬物(miR-222 mimics)hsa-miR-222成熟體序列(5’-AGCUACAUCUGGCUAC-UGGGU-3’)、陰性對(duì)照(5’-AAAAGAGACCGGUUCACUGUGA-3’)均購(gòu)于上海吉瑪生物公司；miR VanaTMPARlSTM試劑盒購(gòu)自ABI公司、iScripTM模板DNA合成試劑盒購(gòu)自BIO-RAD公司、QPCR熒光定量試劑盒購(gòu)自Takaka公司。細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；胰島素購(gòu)自甘李藥業(yè)，Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；細(xì)胞裂解液、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗大鼠二抗購(gòu)自Cell Signaling公司，兔抗大鼠PARP-1一抗購(gòu)自Chemicon公司；tPA、PAI-1 ELI-SA試劑盒購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，Taq DNA聚合酶購(gòu)自Takaka公司。其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

二、方 法

1.靶基因預(yù)測(cè)

Targetscan生物學(xué)信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)PARP-1是人miR-222的靶基因，并找出其可能結(jié)合的位點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 hsa-miR-222與PARP-13’-非翻譯區(qū)結(jié)合的位點(diǎn)

2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組

HMC培養(yǎng)于含有15%胎牛血清及0.6 U/ml胰島素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)至85%融合后，換用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，后換用新鮮無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，并分成4組：正常糖(5 mmol/L)組、高糖(25 mmol/L)組、高糖+miR-222 mimics陰性對(duì)照組、高糖+miR-222 mimics組。

3.miR-222表達(dá)水平的檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)高糖(25 mmol/L葡萄糖)刺激24 h下HMC的miR-222表達(dá)，采用正常培養(yǎng)基(含5 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)HMC的作對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)樣品，每份樣品重復(fù)檢測(cè)3次。先利用miR VanaTMPARlSTMKit提取包括miR在內(nèi)的總RNA。采用iScripTM模板DNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA，然后使用QPCR熒光定量試劑盒進(jìn)行定量PCR，每份樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，具體按說(shuō)明書操作，最后使用ABI750實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)miR-222的相對(duì)表達(dá)量。

4.目的miR的轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1日，2 ml無(wú)抗生素培養(yǎng)基中接種(2.5～10)×105個(gè)HMC，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%后，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。使用250 μl Opti-MEM低血清培養(yǎng)基稀釋4 μg目的miR(所有對(duì)照組加入等量的無(wú)菌水)并輕輕混勻；250 μl Opti-MEM低血清培養(yǎng)基稀釋10 μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻后室溫靜置5 min，將稀釋好的目的miR及轉(zhuǎn)染試劑溶液混合(總體積500 μl)，輕輕混勻并室溫下靜置20 min，每孔中加入500 μl混合液，十字交叉法搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板使溶液與培養(yǎng)基充分混勻，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

5.PARP-1含量的檢測(cè)

按實(shí)驗(yàn)分組將HMC轉(zhuǎn)染miR-222 mimics陰性對(duì)照組及miR-222 mimics，使用蛋白免疫印跡法檢測(cè)24 h后PARP-1蛋白表達(dá)。收集各組細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入細(xì)胞裂解液, 冰上放置5 min。用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，收集至1.5 ml Eppendorf管中，放置于冰上。用超聲粉碎儀在冰上進(jìn)行超聲粉碎，500 W、1 s共15次，剪切DNA，降低黏稠度。4 ℃、12 000轉(zhuǎn)/分離心10 min，留取上清液。取10 μl上清液測(cè)定濃度，余儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆肹1-2]。上述上清液加蛋白載樣緩沖液，煮沸10 min，瞬時(shí)高速離心，分別取不同樣品的總蛋白50 μg經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，電轉(zhuǎn)移至聚丙氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h， 加入PARP-1的抗體，4 ℃過(guò)夜。洗膜后，再加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后進(jìn)行顯色，曝光于X線膠片上，圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，用Fluor Chem 8900軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化。以 β-actin為內(nèi)參，用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)含量[12]。

6.tPA、PAI-1含量的檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中tPA、PAI-1的含量按照ELISA試劑盒(上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書步驟檢測(cè)[1-2]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、高糖刺激下HMC細(xì)胞miR-222的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR顯示，高糖組HMC在24 h時(shí)miR-222 mRNA表達(dá)水平是正常糖組的(2.537±0.216)倍，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.325，P<0.001)。

二、miR-222對(duì)HMC細(xì)胞PARP-1表達(dá)的影響

多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.934，P<0.001)，其中高糖組HMC中PARP-1蛋白表達(dá)高于正常糖組(P<0.05)，高糖+miR-222 mimics組HMC中PARP-1蛋白表達(dá)低于高糖組(P<0.05)，而高糖+miR-222 mimics陰性對(duì)照組與高糖組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 miR-222對(duì)HMCk PARP-1蛋白表達(dá)的影響

三、miR-222對(duì)HMC細(xì)胞上清液tPA及PAI-1蛋白表達(dá)的影響

多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FtPA=56.846、FPAI-1=127.385、FtPA/PAI-1=94.947，P均<0.001)，其中與正常糖組比較，高糖組的tPA和tPA/PAI-1降低、PAI-1升高(P均<0.05)；與高糖組比較，高糖+mimics組的tPA和tPA/PAI-1升高、PAI-1降低(P均<0.05)。高糖+miR-222 mimics陰性對(duì)照組與高糖組tPA、PAI-1及tPA/PAI-1比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 miR-222對(duì)HMC細(xì)胞上清液tPA/PAI-1的影響

討 論

DN是糖尿病主要的并發(fā)癥之一，是發(fā)達(dá)國(guó)家終末期腎病的首要病因，也是我國(guó)終末期腎病的第二大病因，社會(huì)危害性極大。DN以腎小球系膜基質(zhì)增寬及毛細(xì)血管基底膜增厚為主要特征。DN的發(fā)病過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)堆積是其病理?yè)p害的關(guān)鍵。tPA/PAI-1是一對(duì)主要的纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)，PAI-1是tPA的天然的抑制劑。糖尿病時(shí)，tPA/PAI-1功能紊亂，可下調(diào)tPA表達(dá)，上調(diào)PAI-1表達(dá)，遏制纖溶系統(tǒng)的功能，減少纖溶酶酶原活化，從而減少纖維蛋白/纖維蛋白原降解，抑制ECM降解，在糖尿病ECM沉積中發(fā)揮重要作用[17]。筆者前期研究表明，高糖刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞分泌的tPA蛋白有所下降，PAI-1蛋白明顯增加，tPA/PAI-1比值降低，證實(shí)糖尿病時(shí)tPA/PAI-1功能紊亂[6]。

早期研究報(bào)道參與調(diào)節(jié)多種腫瘤發(fā)生的miR-222，近年也有較多報(bào)道證實(shí)其參與糖尿病的調(diào)節(jié)。有研究表明，2型糖尿病及妊娠期糖尿病患者外周血miR-222-3p明顯下調(diào)[18-19]。另一研究顯示，2型糖尿病患者外周血miR-222明顯上調(diào)[20]。Li等[21]報(bào)道，選擇性下調(diào)miR-10a、miR-139b、miR-206和miR-222的表達(dá)，糖尿病和高脂血癥誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以上調(diào)聯(lián)接蛋白connexin和Rho激酶的表達(dá)。Lightell等[15]報(bào)道，增加細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2活性可反應(yīng)性上調(diào)miR-221和miR-222，并促進(jìn)糖尿病中的新內(nèi)膜增生。Tsukita等[22]研究顯示，miR-106b和miR-222有助于骨髓移植胰腺B細(xì)胞增殖，并改善胰島素缺乏型糖尿病小鼠模型中的高血糖癥。Neijenhuis等[16]研究亦顯示，hsa- miR-222過(guò)表達(dá)可抑制RAD51表達(dá)，損害細(xì)胞同源重組功能，進(jìn)而增加對(duì)PARP抑制劑olaparib的敏感性。

PARP是一類能選擇性識(shí)別并結(jié)合DNA缺口的DNA結(jié)合蛋白酶。主要分布于細(xì)胞核內(nèi)，少量分布于細(xì)胞漿內(nèi)。PARP-1是由1 014個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，分子量為113 kDa。它是PARP家族中含量最豐富，也是最重要的成員[23]。筆者前期研究表明，PARP-1存在于腎小球系膜細(xì)胞中，高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞PARP-1生成增加，同時(shí)下調(diào)tPA/PAI-1比值，并上調(diào)ECM4型膠原、纖連蛋白的表達(dá)；PARP-1特異性抑制劑(PJ34)能下調(diào)PARP-1表達(dá)，同時(shí)部分逆轉(zhuǎn)上述因子的改變[6-7]。PARP-1還參與了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞PAI-1與纖連蛋白表達(dá)[8]。上述研究表明，PARP-1是DN發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要因子。

本研究顯示，高糖可上調(diào)HMC的miR-222，提示miR-222可能參與調(diào)節(jié)糖尿病的發(fā)生、發(fā)展。研究通過(guò)對(duì)HMC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-222 mimics，有效下調(diào)其靶蛋白PARP-1的表達(dá)，進(jìn)一步表明miR-222可靶向調(diào)節(jié)PARP-1。研究還顯示，HMC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-222 mimics，可明顯改善tPA/PAI-1表達(dá)的紊亂。因此，miR-222可能過(guò)靶向調(diào)控PARP-1基因促進(jìn)系膜細(xì)胞纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)的紊亂，這為DN發(fā)展的可能分子機(jī)制提供了新的科學(xué)依據(jù)。