毛葦 陶力 趙心愷 孔燦燦 鄺繼孫 邱敏霞

胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤，居我國腫瘤發(fā)病率的第二位和腫瘤病死率的第三位[1]。胃癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，但原癌基因的激活及抑癌基因的失活是其病變過程中的重要因素?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)特異性基因可能會在胃癌的發(fā)病過程中起到重要作用, 其中抑癌基因Gastrokine 2(GKN2)最近受到較多關(guān)注。GKN2屬于Gastrokine家族，其特點(diǎn)是家族成員編碼的分泌蛋白中均含有一個(gè)保守的BRICHOS結(jié)構(gòu)域[2-3]。BRICHOS結(jié)構(gòu)域是一個(gè)保守蛋白結(jié)構(gòu)域，它由約100個(gè)氨基酸組成，其保守序列主要位于一對可形成二硫鍵并發(fā)揮蛋白折疊作用的半胱氨酸周圍。目前發(fā)現(xiàn)含有BRICHOS結(jié)構(gòu)域的蛋白與一系列重大的疾病相關(guān)，如BRI2與家族性癡呆有關(guān)；ChM-1與軟骨肉瘤相關(guān)；SP-C與呼吸窘迫綜合征相關(guān)；GKN1與胃癌相關(guān)[4-5]。本研究旨在通過比較GKN2在人胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)情況，探討GKN2在胃癌發(fā)生過程中的表達(dá)調(diào)節(jié)，為進(jìn)一步研究GKN2在胃癌中的抑癌機(jī)制提供基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材 料

1.組織標(biāo)本

1.1 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)標(biāo)本

選取2013年1月至2014年12月由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院外科提供的70例胃癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織，所有標(biāo)本均取自胃癌手術(shù)患者并通過組織病理學(xué)檢查確認(rèn)。其中男62例、女8例，年齡(59.4±7.6)歲。

1.2 組織芯片標(biāo)本

另外選取70例來源于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院的胃癌病灶手術(shù)標(biāo)本用于組織芯片，其中男59例、女11例，年齡(61.6±6.6)歲，所有胃癌患者術(shù)前均未接受化學(xué)治療和放射治療。同時(shí)選取70例來源于內(nèi)鏡中心的正常胃黏膜標(biāo)本，男59例、女11例，年齡(61.0±6.0)歲。2組性別構(gòu)成、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

2.主要試劑

GKN2 兔抗人單克隆抗體購自Abnova公司；β-actin鼠抗人單克隆抗體(BA2305)購自博士德公司；二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒購自DAKO公司；RNeasy Mini Kit購自Quiagen公司；ReverTra Ace-α-TM-RT-PCR Kit購自TOYOBO公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.PCR法

1.1 總RNA 提取

使用RNeasy Mini Kit，根據(jù)說明書操作。液氮冷凍條件下將組織研磨成粉末狀，將其移入預(yù)先準(zhǔn)備好的含350 μl RLT液的離心管中，用組織分散機(jī)分散組織粉末，5 ml一次性注射器反復(fù)抽打10次，4 ℃條件下12 000轉(zhuǎn)/分離心5 min，將上清液移入1.5 ml離心管。加入同等體積(約350 μl)70%乙醇液，充分混勻后，全部移入吸附柱中，12 000轉(zhuǎn)/分離心15 s，倒掉收集管內(nèi)的液體。加入700 μl的RW1液，12 000轉(zhuǎn)/分離心15 s，倒掉收集管內(nèi)的液體。先后兩次加RPE液入吸附柱內(nèi)， 12 000轉(zhuǎn)/分分別離心15 s和2 min，均棄去收集管內(nèi)的液體。將吸附柱移入一新的2 ml收集管內(nèi)，12 000轉(zhuǎn)/分離心2 min。將吸附柱移入一新的1.5 ml收集管內(nèi)，加入50 μl RNase-free水，12 000轉(zhuǎn)/分離心1 min。經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定判斷后將所得RNA存儲于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

使用ReverTra Ace-α-TM-RT-PCR Kit，根據(jù)說明書操作。在0.5 ml Eppendorf管中加入中RNA 1 μg，5×RT Buffer 4 μl、Random Primer(25 pmol/μl)1 μl、10 μmol/L dNTP 2 μl、Rever Tra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，再用RNase-Free H2O調(diào)整至總反應(yīng)體系20 μl，充分混勻。將離心管置于PCR儀，設(shè)置程序如下：30 ℃ 10 min，42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后將離心管瞬間離心，所得cDNA儲存于-20℃冰箱備用。

1.3 PCR擴(kuò)增

使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物：正向引物5′-GTGGCATTTTGGTGGTG-3′ ；反向引物 5′-CATTGTTGCTTGGGCTGA-3′，交由Invitrogen公司合成[6]。PCR擴(kuò)增根據(jù)說明書操作。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，28個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增完畢后，取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl混合上樣緩沖液2 μl充分混勻，用1%瓊脂糖凝膠在100 V穩(wěn)壓下電泳40 min，電泳完畢后使用紫外線凝膠成像儀觀察。

2.免疫組織化學(xué)檢查(免疫組化)

2.1 組織芯片制備

從病理科調(diào)取原始標(biāo)本石蠟塊，復(fù)習(xí)病理診斷及選取芯片打孔位置。比對帶有打孔標(biāo)記的切片，在供體蠟塊上的相應(yīng)部位打孔采集組織芯片，將組織芯片轉(zhuǎn)移到受體蠟塊的孔中，將組織芯片快速連續(xù)切片20張，每張約厚4 μm。

2.2 免疫組化染色

將所得組織芯片切片60 ℃烤片，二甲苯脫蠟10 min×3次，梯度濃度乙醇(100%，95%，85%，75%，70%)脫水各5 min，蒸餾水洗5 min×3次。切片置于10 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中，微波加熱(95 ℃，10 min)修復(fù)抗原，室溫下自然冷卻后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3 min×3次。切片置于0.3%過氧化氫室溫孵育15 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，后PBS洗5 min×3次。正常山羊血清封閉液室溫孵育10 min。滴加一抗室溫孵育1 h(GKN2一抗?jié)舛?∶300)。滴加二抗(HRP標(biāo)記的即用型二抗工作液)室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、 胃癌組織和癌旁正常組織的GKN2 mRNA對比

RT-PCR結(jié)果顯示，GKN2 mRNA在癌旁正常組織中全部高表達(dá)，陽性率為100%；GKN2 mRNA在胃癌組織中僅有 7例表達(dá)但表達(dá)明顯下調(diào)，其余表達(dá)缺失，陽性率為10%。胃癌組織和癌旁正常組織GKN2 mRNA陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=63.00,P<0.001)，見圖1。

圖1 胃癌組織和癌旁正常組織中GKN2 mRNA的表達(dá)

二、 胃癌組織和正常胃組織的GKN2蛋白表達(dá)對比

免疫組化結(jié)果顯示，70例正常胃組織的GKN2呈強(qiáng)染色，分布在正常胃黏膜上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，陽性率為100%。而70例胃癌組織標(biāo)本中，僅有5例呈弱陽性表達(dá)，其余65例均表達(dá)缺失，陽性率為7%。胃癌組織和正常胃組織的GKN2蛋白陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=121.33,P<0.001)，見圖2。

圖2 正常胃組織和胃癌組織的GKN2蛋白表達(dá)

討 論

GKN2只特異性地表達(dá)于正常胃黏膜上皮細(xì)胞，非胃上皮組織組織均無表達(dá)[7]。本研究顯示，GKN2主要表達(dá)于腺體的中上部分，以胃黏膜表面的上皮細(xì)胞最為明顯，越往深部其在腺體中的表達(dá)越弱。這與GKN1的表達(dá)分布十分相似，我們推測GKN2也可能通過胞吐的方式分泌出去，構(gòu)成胃上皮黏液層的一部分抵御損害，并促進(jìn)受損胃黏膜的修復(fù)。有研究顯示，在胃黏膜炎性反應(yīng)過程中，GKN2起著胃黏膜保護(hù)作用，能夠抑制幽門螺桿菌對胃黏膜的炎性損害，避免胃黏膜進(jìn)入癌變過程[8]。這提示GKN2能夠維護(hù)胃黏膜上皮的完整性并促進(jìn)受損的胃黏膜進(jìn)行修復(fù)。GKN2還可與TFF1形成二聚體在正常胃黏膜中表達(dá)。而TFF1在胃中起著胃黏膜保護(hù)因子的作用，能夠增強(qiáng)胃黏膜上皮防御酸和食物誘發(fā)損傷的能力；誘發(fā)細(xì)胞移行的信號傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞移行從而促進(jìn)受損黏膜重建；促進(jìn)胃上皮細(xì)胞分化，幫助細(xì)胞內(nèi)蛋白的折疊[9-10]。因此推測GKN2在胃中也扮演類似的黏膜保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，GKN2在正常胃粘膜細(xì)胞中高表達(dá)，但是在胃癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)甚至缺失。有研究報(bào)道GKN2在胃癌細(xì)胞株、胃腸上皮化生組織和胃組織中表達(dá)明顯下降或缺失[11-12]。這與我們的結(jié)果相似，提示GKN2的表達(dá)缺失可能是胃癌發(fā)生的重要因素。Moss等[13]研究了155個(gè)遠(yuǎn)端胃腺癌中GKN2的表達(dá)趨勢，發(fā)現(xiàn)GKN2在大多數(shù)胃癌組織中表達(dá)缺失或明顯下降；而且GKN2的表達(dá)缺失在臨床中可作為提示患者生存期縮短的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。目前已經(jīng)證實(shí)GKN2能夠通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲發(fā)揮，抑制上皮間質(zhì)化等抑癌作用。其能夠激活包括JAK/STAT、PI3K/AKT/GSK3β、NF-Kβ等在內(nèi)的信號通路發(fā)揮作用[14]。GKN2與TFF1形成的二聚體也在胃癌中表達(dá)下降[15]。而TFF1已經(jīng)被證實(shí)在胃黏膜中具有抑癌作用，TFF1通過調(diào)節(jié)經(jīng)典的cyclinD1-CDKs-CKIs-pRb-E2F通路，延遲腫瘤細(xì)胞從G1到S期的轉(zhuǎn)化，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16]。因而GKN2與TFF1二聚體表達(dá)的缺失也可能是參與了胃癌發(fā)生的進(jìn)程。

綜上所述，GKN2在正常胃黏膜中高表達(dá)，但是在胃癌中表達(dá)下調(diào)甚至缺失，這可能是導(dǎo)致胃癌發(fā)生的重要因素。