洪璇，陳仲巍，李鶴賓，楊丙曄，羅浩虹，林啟凰

（廈門醫(yī)學院廈門市海洋醫(yī)用天然產(chǎn)物與細胞工程重點實驗室，福建廈門361023）

雞桑（Morus australis）是桑科，桑屬小喬木或灌木，在我國的大部分省份均有分布，雞桑在我國具有數(shù)千年的種植歷史，是一種重要的經(jīng)濟作物[1]。雞桑營養(yǎng)豐富，含有人體必需的生物堿、維生素、氨基酸、多糖和黃酮等多種天然有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老、降血壓、降血糖、降血脂等多種生理功能[2-3]。其中多糖是自然界中動植物等生物體內(nèi)具有某種特殊生物學功能的高分子碳水化合物，具有預防動脈硬化、延緩衰老、抗腫瘤﹑抗炎、抗氧化等多種生理活性[4-5]。但由于對雞桑研究及加工技術(shù)的缺乏，經(jīng)濟價值一直沒有得到充分的體現(xiàn)。本文對雞桑葉多糖進行提取，并對提取工藝進行了優(yōu)化，為進一步開發(fā)雞桑葉為天然食品抗氧化劑和天然藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞桑葉：采于廈門市同安區(qū)五顯鎮(zhèn)；乙醇（食用級）：浙江共輝食品科技有限公司；其它試劑均為分析純。

UV-1800PC-DS2型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司生產(chǎn)的；KQ-100DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取工藝

將采摘的雞桑葉浸泡于蒸餾水，洗凈，自然晾干，并于50℃的鼓風干燥箱中干燥，粉碎，取60目～80目的粉末，備用。稱取一定量備用的雞桑葉，加入無水乙醇進行浸泡，過濾，得濾渣，將石油醚加入到濾渣中進行脫脂脫色，過濾并干燥得濾渣。將濾渣加入到燒瓶中，按照所考察的因素及條件進行回流。操作工藝結(jié)束后，加入Sevag試劑進行震蕩，靜置分液除去有機層，后過濾得濾液，將濾液進行濃縮后在容量并中定容。

1.2.2 多糖含量的測定

按文獻[6]方法對定容后的雞桑葉提取液進行多糖含量的測定，并計算出雞桑葉多糖的提取率：

其中：b為雞桑葉多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液定容后的體積，mL；m為雞桑葉質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗

在其它條件固定的條件下，固定超聲功率80 W、超聲時間25 min、超聲溫度75℃和液料比20∶1（mL/g），考察超聲功率（60、70、80、90 W 和 100 W）、超聲時間（15、20、25、30 min 和 35 min）、超聲溫度（65、70、75、80℃和85℃）和液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）和30 ∶1（mL/g）]、對雞桑葉多糖提取率的影響。

1.2.4 響應面設計

根據(jù)1.2.3試驗的結(jié)果進行Box-Behnken試驗設計，以雞桑葉多糖提取率為響應值，以超聲功率（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）和液料比（D）四因素為自變量，進行響應面優(yōu)化，因子編碼及水平如表1所示。

表1 因素與水平編碼表Table1 Code table of factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲功率的影響

超聲功率對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on yield of polysaccharides

由圖1可知，當超聲功率達到80 W時，雞桑葉多糖提取率達到最大值。這是因為提取系統(tǒng)的空化、剪切等作用會隨著超聲功率的增大而增強，從而促進了多糖的溶出，而當超聲功率過大時，空化等作用太強，溶劑中的某些區(qū)域會瞬時升溫，部分多糖分子鏈會斷裂而分解[7]。因此超聲功率選擇為80 W。

2.1.2 超聲時間的影響

超聲時間對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of polysaccharides

由圖2可知，當超聲時間達到25 min時，雞桑葉多糖提取率達到最大值。這是因為雞桑葉顆粒與溶劑的接觸與傳質(zhì)時間會隨著超聲時間的延長而增大，促進多糖的溶出，而當超聲時間太長時，長時間的空化和熱等作用下，多糖分子鏈會斷裂而分解[8]。因此超聲時間選擇為25 min。

2.1.3 超聲溫度的影響

超聲溫度對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on yield of polysaccharides

由圖3可知，當超聲溫度達到75℃時，雞桑葉多糖提取率達到最大值。這是因為提取系統(tǒng)溶劑與雞桑葉顆粒的碰撞與傳質(zhì)會隨著超聲溫度的升高而增大，從而使得多糖溶出量增大，而當超聲溫度過高時，多糖中耐熱性較差的部分會發(fā)生熱分解[9]。因此超聲溫度選擇為75℃。

2.1.4 料液比的影響

液料比對多糖提取率的影響見圖4。

圖4 液料比對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-material ratio on yield of polysaccharides

由圖4可知，當液料比達到20∶1（mL/g）時，雞桑葉多糖提取率達到最大值，這是因為雞桑葉顆粒內(nèi)部多糖與溶劑間的濃度梯度會隨著提取體系溶劑量增加而增大，使得多糖更容易溶出，而當液料比過大時，雞桑葉顆粒中的雜質(zhì)會與多糖產(chǎn)生溶出競爭[10]。因此液料比選擇為 20 ∶1（mL/g）。

2.2 響應面優(yōu)化雞桑葉多糖工藝

2.2.1 響應面試驗

在2.1單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken設計進行試驗，以雞桑葉多糖提取率為響應值，得到試驗結(jié)果如表2，并進行響應面與方差分析得表3。

表2 Box-Benhnken試驗設計及結(jié)果Table2 Box-Benhnken design and result

表3 回歸模型的分析結(jié)果Table3 Analysis results of regression

續(xù)表3 回歸模型的分析結(jié)果Continue table 3 Analysis results of regression

雞桑葉多糖提取率（Y）與超聲功率（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）和液料比（D）四因素的四元二次回歸方程可通過表2的試驗數(shù)據(jù)分析得到：

表3的顯著性和方差分析顯示，該回歸方程極顯著（F=24.02，P＜0.000 1）；相關(guān)系數(shù) R2=0.960 0，說明有超過96%以上的真實值可以用該模型來反映。失擬項不顯著（F=5.56，P=0.056 3＞0.05），說明該模型擬合情況較好，受其它因素影響較小?；貧w方程中一次項D，交互項AC、AD對雞桑葉多糖提取率影響不顯著（P＞0.05）；一次項A、B對雞桑葉多糖提取率影響顯著（P＜0.05）；一次項 C，交互項 AB、BC、BD、CD，二次項 A2、B2、C2、D2對雞桑葉多糖提取率影響極顯著（P＜0.01），說明雞桑葉多糖提取率與所考察的超聲功率、超聲時間、超聲溫度和液料比等工藝與之間不是簡單的線性關(guān)系。從方差分析中的F值及P值可知，所考察的4個因素的主次順序為：超聲溫度＞超聲功率＞超聲時間＞液料比。綜上分析，說明該響應面模型有效，可靠性好。

2.2.2 交互作用分析

利用Design-Expert 8.05b軟件對超聲功率、超聲時間、超聲溫度和液料比之間兩兩交互作用的關(guān)系作出響應面及等高線圖，如圖5所示。通過圖中可以得到所考察因素所對應范圍內(nèi)的極大值點，從等高線可以看出各因素的影響程度。

圖5 各因素交互作用對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of factors interaction on yield of polysaccharide

由圖5a可知，超聲功率和超聲時間對雞桑葉多糖提取率的交互作用極顯著，當超聲功率為80 W，超聲時間為25 min時，多糖提取率達到最大；從等高線圖可知，超聲功率對多糖提取率影響比超聲時間更為顯著。由圖5b可知，超聲功率和超聲溫度對雞桑葉多糖提取率的交互作用不顯著，當超聲功率為80 W，超聲溫度為75℃時，多糖提取率達到最大；從等高線圖可知，超聲溫度對多糖提取率影響比超聲功率更為顯著。由圖5c可知，超聲功率和液料比對雞桑葉多糖提取率的交互作用不顯著，當超聲功率為80 W，液料比為20∶1（mL/g）時，多糖提取率達到最大；從等高線圖可知，超聲功率對多糖提取率影響比液料比更為顯著。由圖5d可知，超聲時間和超聲溫度聲時間對雞桑葉多糖提取率的交互作用極顯著，當超聲時間為25 min，超聲溫度為75℃時，多糖提取率達到最大；從等高線圖可知，超聲溫度對多糖提取率影響比超聲時間更為顯著。由圖5e可知，超聲時間和液料比對雞桑葉多糖提取率的交互作用極顯著，當超聲時間為25 min，液料比為20∶1（mL/g）時，多糖提取率達到最大；從等高線圖可知，超聲時間對多糖提取率影響比液料比更為顯著。由圖5f可知，超聲溫度和液料比對雞桑葉多糖提取率的交互作用極顯著，當超聲溫度為80℃，液料比為25∶1（mL/g）時，多糖提取率達到最大；從等高線圖可知，超聲溫度對多糖提取率影響比液料比更為顯著。

2.2.3 驗證試驗

利用響應面軟件對所得的二次回歸方程進行分析得到雞桑葉多糖的最佳提取工藝為超聲功率80.23 W、超聲時間25.86 min、超聲溫度73.28℃和液料比18.71∶1（mL/g），在最佳的預測工藝條件下，多糖提取率的最大值為48.41 mg/g。結(jié)合試驗操作的便利性，將工藝修正為超聲功率80 W、超聲時間26 min、超聲溫度73℃和液料比19∶1（mL/g），在修正后的工藝條件下，進行平行試驗，得到雞桑葉多糖的平均提取率為 48.21 mg/g，與預測值相比（48.41 mg/g），其相差為0.41%，說明該響應面模型有效，可靠性好，該研究為雞桑葉多糖的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

以雞桑葉為原料，對影響雞桑葉多糖提取率因素進行考察并進行Box-Behnken設計和響應面優(yōu)化，獲得最佳提取工藝為：超聲功率80 W、超聲時間26 min、超聲溫度73℃和液料比19∶1（mL/g）。在該條件下，雞桑葉多糖的提取率為48.21 mg/g，與預測值相比（48.41 mg/g），其相差為0.41%，說明該響應面模型有效，可靠性好。該研究為雞桑葉多糖的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。