姜麗楠，閆紅偉，羅明正，崔 鑫，沈旭芳，王連順，劉海映，劉 奇

( 1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院， 遼寧 大連 116000； 3.大連海洋大學(xué)，遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116000 )

口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)是我國(guó)沿海重要的經(jīng)濟(jì)種類，其肉嫩味美，營(yíng)養(yǎng)豐富，在許多國(guó)家和地區(qū)都是重要的漁業(yè)資源[1-3]。在我國(guó)，由于捕撈過(guò)度及環(huán)境惡化等因素影響，口蝦蛄資源嚴(yán)重衰退[4-5]，市場(chǎng)價(jià)格日益攀升。為保護(hù)現(xiàn)有資源并滿足日益增長(zhǎng)的消費(fèi)需求，口蝦蛄人工增殖、養(yǎng)殖迫在眉睫[6]。而充分了解其特殊的繁殖生物學(xué)特征，是實(shí)現(xiàn)人工增養(yǎng)殖的重要基礎(chǔ)。

目前，在口蝦蛄性腺發(fā)育與人工繁育方面，國(guó)內(nèi)外均開展了一系列研究工作。如口蝦蛄精巢與卵巢發(fā)育分期規(guī)律已基本摸清[7-9]；分布在我國(guó)和日本的口蝦蛄主要種群繁殖生物學(xué)規(guī)律也有詳細(xì)報(bào)道[10-12]；在繁殖功能相關(guān)基因的克隆與表達(dá)也有初步研究[13]。20世紀(jì)80—90年代，Hamano 等[14-17]對(duì)口蝦蛄產(chǎn)卵、孵化、幼體發(fā)育、生長(zhǎng)及營(yíng)底棲生活洞穴等情況進(jìn)行了詳細(xì)研究，為人工育苗和最終養(yǎng)成奠定了重要基礎(chǔ)。王波等[18]首次對(duì)口蝦蛄人工育苗開展探究，孫丕喜等[19]以在水泥池底放置泥沙的方法來(lái)培育口蝦蛄親體并獲成功。王春琳等[20-21]利用土池進(jìn)行親蝦促熟和抱卵孵化，苗種供應(yīng)問(wèn)題初步得到解決。此外，劉海映[22]在我國(guó)北方也基于土池育苗方法，采用生物餌料，優(yōu)化現(xiàn)有育苗工藝，多次成功促熟雌性口蝦蛄，所產(chǎn)苗種質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)一步得到提高。以上研究極大地豐富了口蝦蛄繁殖生物學(xué)的研究?jī)?nèi)涵，但在人工調(diào)控繁殖方面，依然鮮見研究。

眼柄中的X器官—竇腺?gòu)?fù)合體是甲殼動(dòng)物的重要內(nèi)分泌器官，分泌性腺抑制激素和高血糖激素等神經(jīng)肽類物質(zhì)參與調(diào)節(jié)性腺成熟。Panouse[23]首次發(fā)現(xiàn)切除鋸齒長(zhǎng)臂蝦(Palaemonserratus)眼柄能促進(jìn)卵巢發(fā)育成熟。隨后研究人員對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[24]、克氏原螯蝦(Proucambarusclarkii)[25]、中華絨鰲蟹(Eriocheirsinensis)[26]、遠(yuǎn)海梭子蟹(Portunuspelagicus)[27]及日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)[28]等也進(jìn)行了相關(guān)研究，并再次證實(shí)眼柄切除確實(shí)可不同程度地促進(jìn)甲殼動(dòng)物卵巢快速發(fā)育成熟，顯著提高甲殼動(dòng)物人工養(yǎng)殖效率。研究亦表明，雙側(cè)眼柄切除對(duì)蝦蟹類的攝食行為、游泳行為等諸多方面的影響要比單側(cè)眼柄切除劇烈，且動(dòng)物因機(jī)械損傷承受的痛苦更明顯，故單側(cè)眼柄切除比雙側(cè)眼柄切除具有更高的存活率，人工養(yǎng)殖效果也更好[29]。截至目前，有關(guān)眼柄切除對(duì)甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖的影響研究主要集中于十足目種類上，而對(duì)口足目研究較少?？谖r蛄作為口足目中的優(yōu)勢(shì)種群，切除眼柄能否促進(jìn)卵巢發(fā)育，以及對(duì)卵巢、肝胰臟和肌肉中生化組成的影響尚未見報(bào)道。

筆者在口蝦蛄卵巢發(fā)育期切除其單側(cè)眼柄，分析性腺指數(shù)、肝胰腺指數(shù)以及機(jī)體重要部位生化組分的變化，以了解眼柄在口蝦蛄生長(zhǎng)，發(fā)育和繁殖過(guò)程中的內(nèi)分泌功能，為相關(guān)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年4月初在口蝦蛄卵巢發(fā)育期，自遼寧省大連市皮口海域采集體表光滑、附肢完整、活力強(qiáng)、卵巢發(fā)育周期相近并開始發(fā)育的雌性口蝦蛄160尾，經(jīng)低溫處理后運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，于循環(huán)海水水族箱內(nèi)暫養(yǎng)。采集的口蝦蛄樣本體長(zhǎng)為10.20～15.20 cm，體質(zhì)量為18.24～39.98 g。經(jīng)短暫升溫后，水溫控制在23 ℃，每日數(shù)次投喂沙蠶、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)等新鮮餌料直至飽食。每日補(bǔ)充20%新鮮海水，飽和充氣。

1.2 方法

1.2.1 單側(cè)眼柄切除

暫養(yǎng)14 d后，隨機(jī)挑選10尾雌性口蝦蛄，解剖并分別取出卵巢、肝胰臟和肌肉組織，記錄卵巢和肝胰臟質(zhì)量，分別放入樣本袋中于-80 ℃冰箱保存待用。然后再隨機(jī)選取雌蝦80尾，采用鑷燙法切除右側(cè)眼柄，作為試驗(yàn)組。同時(shí)去除暫養(yǎng)過(guò)程中的死亡個(gè)體和活力不強(qiáng)個(gè)體，剩余60尾雌蝦蛄作對(duì)照組。養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)條件一致。試驗(yàn)開始后分別在第5、10、15、20 d和25 d，每次采集試驗(yàn)組與對(duì)照組口蝦蛄各10尾，樣品處理方法與上述相同，所有個(gè)體均解剖出卵巢、肝胰臟和肌肉組織，分別放入樣本袋中于冰箱-80 ℃保存待用。

1.2.2 性腺指數(shù)和肝胰腺指數(shù)

利用下列公式計(jì)算雌性口蝦蛄性腺指數(shù)和肝胰腺指數(shù)，其中體質(zhì)量、卵巢質(zhì)量和肝胰臟質(zhì)量均為濕質(zhì)量狀態(tài)下所測(cè)數(shù)據(jù)。

性腺指數(shù)/%=m1/m×100%

肝胰腺指數(shù)/%=m2/m×100%

式中，m為體質(zhì)量，m1為卵巢質(zhì)量,m2為肝胰臟質(zhì)量。

1.2.3 糖原與蛋白含量測(cè)定

將第0、5、10、15、20 d和25 d采集到雌性口蝦蛄卵巢、肝胰臟和肌肉組織按取樣時(shí)間分別混勻，制成混樣。一方面，設(shè)置3組平行，各個(gè)組織分別稱量出0.2 g，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%生理鹽水，按體積比1∶9混合勻漿，7500 r/min離心10 min后取上清液，使用蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定不同組織的總蛋白含量；另一方面，按取樣時(shí)間將各個(gè)組織的混樣冷凍干燥后，也設(shè)置3組平行，分別稱量0.05 g，采用蒽酮比色法測(cè)定糖原含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)檢驗(yàn)同一取樣時(shí)間試驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異。*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；使用單因素方差依次分析整個(gè)試驗(yàn)階段性腺指數(shù)和肝胰腺指數(shù)及生化組成的變化。當(dāng)方差齊時(shí)，使用Turkey命令進(jìn)行組間多重比較；當(dāng)方差不齊時(shí)，使用Tamhane′s T2 (M) 進(jìn)行近似檢驗(yàn)，以不同字母表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異 (P<0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 切除眼柄的雌性口蝦蛄的性腺指數(shù)

試驗(yàn)組口蝦蛄性腺指數(shù)在切除眼柄后逐漸上升，在第15 d達(dá)到峰值(12.1%)后下降；而對(duì)照組口蝦蛄性腺指數(shù)在整個(gè)試驗(yàn)期間也存在相應(yīng)趨勢(shì)。此外，在第5、10、15 d時(shí)，試驗(yàn)組口蝦蛄性腺指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(圖1)。

2.2 切除眼柄的雌性口蝦蛄的肝胰腺指數(shù)

試驗(yàn)期間，對(duì)照組與試驗(yàn)組口蝦蛄肝胰腺指數(shù)分別為2.5%～3.3%和2.6%～3.4%，變化趨勢(shì)基本一致。在各取樣點(diǎn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，但試驗(yàn)前期(第0、5、10 d)的肝胰腺指數(shù)顯著高于后期(第15、20 d)(P<0.05)(圖2)。

2.3 切除眼柄后雌性口蝦蛄各組織糖原的含量

切除眼柄前，雌性口蝦蛄卵巢中糖原含量為1.0%。切除眼柄后，卵巢中的糖原含量逐漸上升，在眼柄切除后第15 d達(dá)到峰值(3.0%)后下降，在第20 d降至1.7%，試驗(yàn)組內(nèi)存在顯著差異(P<0.05)(圖3)。對(duì)照組卵巢中的糖原含量也呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在第10 d達(dá)到峰值(2.4%)后回落；組內(nèi)各取樣點(diǎn)間也存在顯著差異(P<0.05)。試驗(yàn)組糖原含量高于對(duì)照組，在第5、15 d兩者分別具有顯著(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)。

切除眼柄前，雌性口蝦蛄肝胰臟中糖原含量為1.0%，之后，試驗(yàn)組糖原含量逐漸上升，在第10 d上升至最大值(5.2%)后下降，且試驗(yàn)組內(nèi)各取樣點(diǎn)間存在顯著差異(P<0.05)(圖3)；對(duì)照組肝胰臟中的糖原含量變化趨勢(shì)與試驗(yàn)組類似。然而，各采樣點(diǎn)試驗(yàn)組的糖原含量均明顯高于對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)。

圖1 切除眼柄后雌性口蝦蛄的性腺指數(shù)不同大寫和小寫字母分別代表試驗(yàn)組和對(duì)照組組內(nèi)取樣點(diǎn)間差異顯著(P<0.05).*，代表試驗(yàn)組和對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，**，代表試驗(yàn)組和對(duì)照組差異極顯著(P<0.01).其他圖同.

圖2 切除眼柄后雌性口蝦蛄的肝胰腺指數(shù)

切除眼柄前，雌性口蝦蛄肌肉中糖原含量也為1.0%，而后試驗(yàn)組肌肉中的糖原含量逐漸上升，并在第5 d達(dá)到最高值(2.4%)，隨后不斷下降，第25 d達(dá)最低值(0.6%)，組內(nèi)各取樣點(diǎn)間存在顯著差異(P<0.05)。對(duì)照組肌肉中的糖原含量變化趨勢(shì)與試驗(yàn)組類似，起初逐漸升高，在第10 d達(dá)到最高值(2.4%)后逐漸下降，同樣至第25 d達(dá)最低值(0.2%)，組內(nèi)各取樣點(diǎn)間差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)組糖原含量在第25 d顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 切除眼柄后雌性口蝦蛄各組織蛋白的含量

切除眼柄前，雌性口蝦蛄卵巢中的蛋白含量為113.4 mg/g，切除眼柄后，卵巢中的蛋白含量在第0～10 d無(wú)明顯變化，在第15 d達(dá)到峰值(142.4 mg/g)，隨后下降。在整個(gè)試驗(yàn)階段，對(duì)照組口蝦蛄卵巢中的蛋白含量波動(dòng)不大，在第20 d達(dá)到峰值(125.7 mg/g)。眼柄被切除后，卵巢中的蛋白含量高于對(duì)照組，在第15 d存在極顯著差異(P<0.01)。

圖3 切除眼柄后雌性口蝦蛄不同組織的糖原的含量

切除眼柄前，雌性口蝦蛄肝胰臟中蛋白含量為31.5 mg/g，切除眼柄后，蛋白質(zhì)含量顯著上升，于第25 d上升至最高值(55.3 mg/g)。對(duì)照組肝胰臟中的蛋白質(zhì)含量變化規(guī)律與試驗(yàn)組不同，蛋白含量在0～5 d逐漸上升，而在5～10 d迅速下降，并到最低值(20.7 mg/g)，隨后蛋白含量再次上升。試驗(yàn)組肝胰臟中的蛋白含量在第10 d顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)組和對(duì)照組中，組內(nèi)各取樣點(diǎn)間的蛋白含量差異顯著(P<0.05)。

切除眼柄前，雌性口蝦蛄肌肉中蛋白含量為47.0 mg/g，切除眼柄后，肌肉中的蛋白含量略微上升，并在第10 d達(dá)到最高值(64.3 mg/g)，隨后下降，第25 d達(dá)最低值(44.2%);組內(nèi)各取樣點(diǎn)間，蛋白含量差異并不顯著。對(duì)照組在第10 d達(dá)到最高值(88.9 mg/g)，顯著高于試驗(yàn)組(P<0.05)；隨后也開始下降，至第25 d也達(dá)最低值(44.1 mg/g)；對(duì)照組各取樣點(diǎn)間的蛋白含量存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 切除眼柄后雌性口蝦蛄不同組織的蛋白含量

3 討 論

位于眼柄的X器官—竇腺?gòu)?fù)合體能夠分泌多種神經(jīng)肽類激素，包括性腺抑制激素、蛻皮抑制激素、高血糖激素等[30-31]。其中分泌的性腺抑制激素最先見于雌性蝦蟹類，因此又稱卵黃發(fā)生抑制激素[32]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)雄性體內(nèi)也分泌該激素[33]。DeKleijin等[34]對(duì)美洲龍蝦(Homarusamericanus)生殖周期中X-器官性腺抑制激素的mRNA表達(dá)及血淋巴組織中的積累含量研究發(fā)現(xiàn)，性腺抑制激素只在卵黃發(fā)生前期和未成熟期的血淋巴組織中高表達(dá)。故推測(cè)，性腺抑制激素可能抑制卵黃發(fā)生。Warrier等[35]比較歐洲龍蝦(H.gammaeus)幼體和成體卵黃發(fā)生抑制激素發(fā)現(xiàn)，幼體含量遠(yuǎn)高于成體，認(rèn)為卵黃發(fā)生抑制激素在幼體期高表達(dá)有利于機(jī)體發(fā)育，在成體期低表達(dá)有利于卵巢發(fā)育，在性腺發(fā)育期起抑制作用。性腺抑制激素靶器官為卵巢和肝胰臟，它能抑制卵黃發(fā)生和成熟，進(jìn)而抑制甲殼動(dòng)物的卵巢發(fā)育，故切除眼柄可加速蝦蟹類卵巢成熟。Panouse[23]首次提出在鋸齒長(zhǎng)臂蝦卵巢發(fā)育期，切除眼柄阻礙性腺抑制激素分泌，可促進(jìn)卵巢體積增大、卵黃沉積。在其他甲殼類的研究中得到類似結(jié)果[36]。

3.1 切除眼柄后對(duì)雌性口蝦蛄卵巢的影響

口蝦蛄一年性成熟，生物學(xué)最小型約為8 cm[14]。Ohtomi等[10]認(rèn)為日本東京灣口蝦蛄繁殖季節(jié)在4—8月，性成熟高峰期有2個(gè)，分別為4—5月和7—8月。第1個(gè)高峰由體長(zhǎng)超過(guò)10 cm的成熟雌體形成；第2個(gè)高峰則由體長(zhǎng)超過(guò)8 cm的成熟雌體形成。薛梅等[9]認(rèn)為，皮口海域雌性口蝦蛄性成熟高峰期也有2個(gè)，推測(cè)產(chǎn)卵盛期在 5—9 月和 11—12 月。此外，孫丕喜等[19]發(fā)現(xiàn)體長(zhǎng)大于10 cm 的雌性口蝦蛄可以進(jìn)行人工繁育。本試驗(yàn)中所采集的口蝦蛄樣本體長(zhǎng)為10.20～15.20 cm，故適宜人工促熟研究。

本試驗(yàn)中，切除單側(cè)眼柄后，口蝦蛄性腺指數(shù)呈上升趨勢(shì)，切除后5～15 d顯著高于對(duì)照組，意味著與其他蝦蟹類一樣，口蝦蛄眼柄中可能也存在抑制卵巢發(fā)育的性腺抑制激素[37]。上述性腺指數(shù)結(jié)果與凡納濱對(duì)蝦眼柄切除后的報(bào)道[38]一致。同時(shí)，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，眼柄切除后第20 d，對(duì)照組與試驗(yàn)組性腺指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。前期預(yù)試驗(yàn)表明，雙側(cè)切除口蝦蛄眼柄致死率高，因此試驗(yàn)中采用單側(cè)眼柄切除方法，但單側(cè)切除并未能完全抑制性腺抑制激素的分泌，這可能是導(dǎo)致試驗(yàn)組性腺指數(shù)在20 d時(shí)出現(xiàn)下降的主要原因。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道，雌性口蝦蛄在繁殖期，對(duì)所處環(huán)境因子，如底質(zhì)、洞穴結(jié)構(gòu)和光等要求嚴(yán)格，若人工養(yǎng)殖的某種環(huán)境條件不同于自然環(huán)境，很可能對(duì)卵巢發(fā)育有一定的抑制作用，可能造成試驗(yàn)組口蝦蛄性腺指數(shù)下降[39]。另一方面，對(duì)日本囊對(duì)蝦等甲殼類研究發(fā)現(xiàn)，肝胰臟的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以通過(guò)血液傳輸?shù)铰殉灿靡詢?chǔ)存和代謝[40-41]。試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組、對(duì)照組肝胰腺指數(shù)在試驗(yàn)后期均出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，推測(cè)口蝦蛄卵巢在發(fā)育過(guò)程中，肝胰臟中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗或者轉(zhuǎn)移至卵巢所致。

3.2 切除眼柄后對(duì)雌性口蝦蛄生化組分的影響

葡萄糖是甲殼類血淋巴中的主要單糖，能參與合成黏多糖、幾丁質(zhì)、核糖等，或以糖原形式貯存作能源[42]。血淋巴中葡萄糖水平的穩(wěn)定對(duì)神經(jīng)、肌肉以及生殖系統(tǒng)功能至關(guān)重要[43]。肝臟是脊椎動(dòng)物的主要貯能器官，當(dāng)機(jī)體需要能量時(shí)，迅速?gòu)母闻K調(diào)取能量以供機(jī)體使用[44]。而包括甲殼類在內(nèi)的無(wú)脊椎動(dòng)物，一般沒(méi)有單獨(dú)的貯能器官[45]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組和對(duì)照組的口蝦蛄，在卵巢、肝胰臟和肌肉中糖原含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。同時(shí)，試驗(yàn)組口蝦蛄卵巢和肝胰臟中的糖原含量高于對(duì)照組，肌肉中的糖原含量從5 d開始下降，明顯早于對(duì)照組。這些結(jié)果說(shuō)明，無(wú)論眼柄是否被切除，在卵巢發(fā)育過(guò)程中，3種組織中的糖原均作為最直接的供能物質(zhì)，為卵巢發(fā)育提供能量；切除眼柄組的口蝦蛄能量轉(zhuǎn)移與代謝程度更高。

蛋白質(zhì)是生命體維持生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，為卵巢發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等，在甲殼類動(dòng)物卵巢發(fā)育中具有重要作用[46]。一般來(lái)說(shuō)，卵黃蛋白原是雌性卵生成熟甲殼動(dòng)物中的特異蛋白；也是幾乎所有卵生動(dòng)物卵黃蛋白的前體；主要作為一種分子載體運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)到卵細(xì)胞，為胚胎發(fā)生和早期幼體發(fā)育提供蛋白質(zhì)以及微量元素等[47]。劉海映等[48]研究發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄卵黃蛋白原mRNA在肝胰臟和卵巢中均有表達(dá)，表明兩種組織均為卵黃蛋白合成部位。在其他甲殼類中，如凡納濱對(duì)蝦和鋸緣青蟹(Scyllaserrata)，均發(fā)現(xiàn)肝胰臟和卵巢是其卵黃蛋白原的主要合成部位[49-50]。Quackenbush等[51]發(fā)現(xiàn)，切除凡納濱對(duì)蝦單側(cè)眼柄7～14 d，卵巢和肝胰臟中卵黃蛋白原合成速度加快。Pateraki等[52]研究亦發(fā)現(xiàn)，在切除雌性陸蟹(Potamonpotamios)眼柄后，卵黃蛋白合成加速。本研究發(fā)現(xiàn)，切除眼柄后，口蝦蛄肝胰臟中蛋白質(zhì)含量不斷上升，表明切除單側(cè)眼柄，可能促進(jìn)肝胰臟中蛋白質(zhì)，尤其是卵黃蛋白的合成，有助于卵巢發(fā)育。而在卵巢和肌肉中蛋白質(zhì)含量的往復(fù)變化特征可能與物質(zhì)遷移與代謝有關(guān)。上述結(jié)果與凡納濱對(duì)蝦眼柄切除結(jié)果[38]存在差異，這可能是兩者取樣時(shí)間不同造成的；但與中華絨螯蟹研究結(jié)果[26]類似。

本試驗(yàn)研究了切除眼柄后雌性口蝦蛄的性腺指數(shù)和肝胰腺指數(shù)的變化特征，以及卵巢、肝胰臟和肌肉中生化組成成分與對(duì)照組間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，試驗(yàn)結(jié)果有助于加強(qiáng)口足目甲殼動(dòng)物性成熟促進(jìn)機(jī)理的認(rèn)知，為豐富口蝦蛄繁殖內(nèi)分泌學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。