甄靜靜，葉方源，王 都，倪小英，應(yīng)雪萍

( 溫州大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州，325027 )

隨著沿海經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和海洋資源的快速開發(fā)，近岸海域受重金屬污染越來越嚴(yán)重[1-2]。在海洋環(huán)境中，有毒金屬在沉積物和海洋生物中積累，然后通過食物網(wǎng)轉(zhuǎn)移到人類。因此，海洋生物中重金屬含量的檢測和評估變得越來越重要[2]。鎘為非降解型有毒物質(zhì)，易被生物富集并有生物放大效應(yīng)， 嚴(yán)重威脅人類和水生生物的生存[1]。重金屬鎘可通過兩種途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，一是通過鰓吸收水體中的鎘離子再由血液循環(huán)運送至動物體內(nèi)各個部位；二是在攝食過程中經(jīng)由消化道進(jìn)入動物體內(nèi)[3]。溶解的及顆粒狀的金屬可通過跨膜通道或細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入溶酶體或囊泡，隨后通過血液排泄或運輸[4]。有研究表明，鰓長時間與流動水體接觸，相比其他器官更易受到重金屬的污染，已被鑒定為雙殼類動物重金屬積累的主要器官[4-6]。重金屬可通過干擾鰓上皮細(xì)胞的離子運輸進(jìn)入鰓組織，從而損壞鰓的滲透壓調(diào)節(jié)和呼吸功能[7]。翡翠貽貝(Pernaviridis)[8]主要通過鰓器官來富集污染物，故研究鰓的超微結(jié)構(gòu)有助于了解污染物富集規(guī)律。鎘離子導(dǎo)致中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)鰓葉增厚、血腔增大、上皮層破壞、線粒體膨脹直至解體，直接影響鰓組織的能量代謝、離子主動轉(zhuǎn)運機(jī)制及滲透壓調(diào)節(jié)能力[9]。

雙殼類動物的鰓是重金屬富集的主要靶器官之一[4-6]，能最初反應(yīng)出重金屬對機(jī)體的損害，其組織病理學(xué)的改變常被用作檢測水生生物健康和水環(huán)境中重金屬污染的有效和靈敏的標(biāo)志物之一[2,6-7,10]。此外，雙殼類動物因其埋棲的生活方式、廣泛的地理分布、種群密度高且易于積累污染物等特點，被廣泛應(yīng)用于實驗室或野外的重金屬生物累積效應(yīng)試驗[4-7]。文蛤(Meretrixmeretrix)主要生活在潮間帶泥沙中，采用濾食的攝食方式，移動性較低，易受重金屬污染，故常被用作重金屬污染的指示生物[11-12]。

鎘會破壞鰓的結(jié)構(gòu)，且對其呼吸功能及滲透功能產(chǎn)生影響[1,13]。目前關(guān)于鎘對文蛤的研究主要集中在急性毒性[14]、肝胰腺超微結(jié)構(gòu)的影響[15]及生理生化指標(biāo)影響[16-18]，未見鎘對鰓上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響的報道。筆者通過不同劑量的鎘離子對文蛤的短期染毒作用，利用透射電鏡對其鰓上皮細(xì)胞的超薄切片進(jìn)行觀察，研究不同質(zhì)量濃度Cd2+對文蛤鰓上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步探究Cd2+在雙殼類動物鰓中的積累和急性毒性效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用文蛤于2015年7月購自溫州靈昆貝類養(yǎng)殖場。化學(xué)純氯化鎘購自上海天蓮精細(xì)化工有限公司，將其配制成120 mg/L母液，根據(jù)試驗需要，用鹽度15的人工海水稀釋成不同質(zhì)量濃度的Cd2+溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 體外鎘暴露法染毒與處理

根據(jù)文蛤96 h的半致死質(zhì)量濃度(15.01 mg/L)[15]的10%、20%、40%、80%設(shè)置4個染毒劑量，分別為1.5、3、6、12 mg/L，同時設(shè)對照組。每個質(zhì)量濃度設(shè)3組平行樣，每組選取體型相近、活動正常、生長狀況良好的文蛤10枚，在室溫20 ℃、pH 8的環(huán)境中進(jìn)行養(yǎng)殖，每24 h換水一次，期間不投餌，染毒時間為5 d。

1.2.2 超薄切片制作與觀察

染毒結(jié)束后，解剖文蛤并迅速取出鰓，切成1 mm3小塊，在2.5%戊二醛固定液中于4 ℃冰箱內(nèi)固定2 h以上。0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液漂洗3次后，1%鋨酸固定。之后用磷酸鹽緩沖液漂洗3次，蒸餾水漂洗2次。再用1%醋酸鈾染色，丙酮梯度脫水，Epon 812環(huán)氧樹脂包埋、聚合。1%醋酸鈾染色，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，LKB-2088型超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾—檸檬酸鉛雙重染色后，日立-7500透射電鏡觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 對照組文蛤鰓上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

對照組文蛤鰓上皮細(xì)胞核呈圓形或橢圓狀，核膜完整，核內(nèi)物質(zhì)清晰可見(圖1a)。線粒體呈橢圓形，排列規(guī)則，大部分線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整(圖1b～d)。微絨毛分布在細(xì)胞表面，排列緊密，無空泡化現(xiàn)象(圖1b～d)。細(xì)胞膜完整、界限清晰、細(xì)胞排列緊密(圖1c～d)。

2.2 1.5 mg/L Cd2+染毒組文蛤鰓上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

在1.5 mg/L Cd2+染毒組中，鰓上皮細(xì)胞核結(jié)構(gòu)基本完整，呈橢圓形，少數(shù)細(xì)胞的核出現(xiàn)輕微的變形，核膜有輕度的囊泡化現(xiàn)象(圖1e～f)。微絨毛排列齊整，大部分未出現(xiàn)分解情況(圖1e)。線粒體排列整齊，嵴結(jié)構(gòu)清晰，但有少部分嵴發(fā)生斷裂現(xiàn)象(圖1f,g)，且有少部分線粒體形狀發(fā)生變形，內(nèi)部出現(xiàn)空泡狀(圖1h)。上皮細(xì)胞中開始出現(xiàn)溶酶體，但體積較小，僅含極少量的沉積物(圖1f,h)。

2.3 3 mg/L Cd2+染毒組文蛤鰓上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

在3 mg/L Cd2+染毒組中，鰓上皮細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)逐漸開始解體(圖1i)。核膜囊泡化現(xiàn)象較嚴(yán)重(圖1j,k)。微絨毛有脫落現(xiàn)象，排列較松散(圖1i,j,l)。線粒體數(shù)量稍有增加，體積有所增大，部分線粒體中嵴解體較嚴(yán)重(圖1j,k)。細(xì)胞中溶酶體數(shù)量與低質(zhì)量濃度染毒組相比有所增加，且體積開始增大，溶酶體中的沉積物不斷增多(圖1l)。

2.4 6 mg/L Cd2+染毒組文蛤鰓上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

在6 mg/L Cd2+染毒組中，鰓上皮細(xì)胞微絨毛進(jìn)一步解體，并出現(xiàn)大量脫落現(xiàn)象(圖2a)。線粒體腫脹現(xiàn)象明顯，形狀不規(guī)則，嵴進(jìn)一步解體(圖2a,b)。溶酶體數(shù)量增加，內(nèi)部沉淀物明顯增多(圖2a,b)。細(xì)胞核形狀嚴(yán)重變形，核膜多處內(nèi)陷，且核膜囊泡化現(xiàn)象越來越嚴(yán)重(圖2c)。

2.5 12 mg/L Cd2+染毒組文蛤鰓上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

在12 mg/L Cd2+染毒組中，鰓上皮細(xì)胞中線粒體排列混亂，形狀變形，大部分線粒體嵴發(fā)生斷裂，空泡化程度越來越嚴(yán)重(圖2d)。細(xì)胞核嚴(yán)重變形，核膜解體破裂，核內(nèi)物質(zhì)溢出(圖2e)。溶酶體的數(shù)量增加，沉積物增多(圖2f)。微絨毛大量脫落，出現(xiàn)嚴(yán)重的空泡化現(xiàn)象，細(xì)胞器基本泡狀化(圖2d,f)。

3 討 論

鎘是一種有毒的重金屬，它能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生氧化損傷，影響生物的組織結(jié)構(gòu)，從而引起嚴(yán)重的退行性病變[1,14-18]。近年來，人們已逐漸認(rèn)識到基于化學(xué)分析的環(huán)境重金屬污染風(fēng)險評估不能清晰、直觀地表明污染物對水生生物的毒性作用[5]。已知亞致死水平的重金屬會影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致許多海洋生物的重要功能受損，因此用細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化來預(yù)測環(huán)境中重金屬污染的手段越來越受到人們的重視[5-7,15,19]。鎘主要積累在腎、肝、鰓3個靶器官中，其中，鰓是至少能螯合或解除鎘作用的重要器官[10]。鰓由各種柱狀上皮、鱗狀細(xì)胞和黏液細(xì)胞組成，是貝類與水體進(jìn)行氣體交換、排泄、滲透壓調(diào)節(jié)、過濾食物、保護(hù)層的形成和上皮表面潤滑等作用的主要器官[7]。鰓結(jié)構(gòu)的受損，會影響生物體的呼吸和進(jìn)食，破壞生物體內(nèi)離子平衡，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致生物體的死亡[1,6,20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，即使是短期暴露于不同質(zhì)量濃度的Cd2+也會導(dǎo)致鰓上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，其損傷程度與Cd2+暴露質(zhì)量濃度成正相關(guān)，主要體現(xiàn)在細(xì)胞核、線粒體等主要細(xì)胞器及微絨毛等的影響，這與已有的研究結(jié)果相似[1,4,6,15,19-20 ]。Wang等[22]的研究也表明，隨著Cd2+質(zhì)量濃度的升高和染毒時間的延長，河南華溪

圖1 0、1.5、3 mg/L Cd2+文蛤鰓上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) a～d為對照組鰓上皮細(xì)胞； e～h為1.5 mg/L Cd2+染毒組鰓上皮細(xì)胞； i～l為3 mg/L Cd2+染毒組鰓上皮細(xì)胞. a: 結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞核(比列尺=2 μm)；b: 結(jié)構(gòu)完整的線粒體和微絨毛(比列尺=0.5 μm)； c: 示細(xì)胞緊密排列(比列尺=1 μm)； d: 微絨毛和細(xì)胞結(jié)構(gòu)(比列尺=1 μm)； e: 緊密排列微絨毛及稍變形的細(xì)胞核(比列尺=1 μm)；f: 溶酶體和線粒體(比列尺=0.5 μm)； g: 線粒體(比列尺=0.5 μm)；h: 溶酶體和輕度空泡化的線粒體(比列尺=0.5 μm)； i: 核物質(zhì)流失的細(xì)胞核(比列尺=2 μm)；j: 部分微絨毛解體，核膜腫脹(比列尺=0.5 μm)； k: 線粒體內(nèi)嵴解體(比列尺=0.2 μm)；l: 溶酶體的數(shù)量增多，體積增大(比列尺=0.5 μm). Ly.溶酶體； M.線粒體； Mc.線粒體嵴； Mv.微絨毛； N.細(xì)胞核.

圖2 6、12 mg/L Cd2+文蛤鰓上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)a: 6 mg/L Cd2+組，示微絨毛的進(jìn)一步解體(比列尺=0.5 μm)；b: 6 mg/L Cd2+組，示溶酶體(比列尺=0.5 μm)；c: 6 mg/L Cd2+組，示細(xì)胞核變形、核膜泡化(比列尺=0.5 μm)；d: 12 mg/L Cd2+組，示線粒體和微絨毛的解體、變形(比列尺=0.5 μm)；e: 12 mg/L Cd2+組，示嚴(yán)重變形的細(xì)胞核(比列尺=0.2 μm)；f: 12 mg/L Cd2+組，示溶酶體(比列尺=0.5 μm). Ly.溶酶體； M.線粒體； Mc.線粒體嵴； Mv.微絨毛； N.細(xì)胞核.

蟹(Sinopotamonhenanense)鰓的結(jié)構(gòu)受損程度加劇，有明顯的時間—含量—效應(yīng)關(guān)系。但Cd2+導(dǎo)致文蛤鰓上皮細(xì)胞損傷的機(jī)理有待于進(jìn)一步從生理、生化及分子生物學(xué)方面深入研究。

Domouhtsidou等[7]的研究認(rèn)為，雙殼類動物對金屬離子的吸附和毒性作用機(jī)制應(yīng)與溶酶體的功能緊密相連。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd2+質(zhì)量濃度的上升，文蛤鰓上皮細(xì)胞中溶酶體的數(shù)量和大小都在增加，溶酶體內(nèi)部的沉淀物顏色加深，可能是重金屬處理后水解酶的活性增加，也可能是一種防御反應(yīng)機(jī)制，以補(bǔ)償重金屬暴露后細(xì)胞代謝的紊亂。這在美洲牡蠣(Crassostreavirginica)[23]的鰓中也得到了類似的結(jié)論，即Cd2+在溶酶體內(nèi)聚集，溶酶體對重金屬積累會產(chǎn)生不溶性顆粒，之后通過滯留或者細(xì)胞分泌從而解毒。因此，將積累的Cd2+輸送到溶酶體，通過解毒功能減輕潛在的毒性。Giarratano等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在許多海洋生物的組織細(xì)胞內(nèi)有溶酶體—液泡系形成的有膜包被的高含量重金屬顆粒，能起到積累解毒的作用，其中包括鐵、銅、鉛、鋅等重金屬。Sokolova等[23]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量會隨著重金屬染毒質(zhì)量濃度的升高而增加，并認(rèn)為可能是為了補(bǔ)償重金屬毒性對生物體結(jié)構(gòu)功能造成影響從而導(dǎo)致的呼吸作用的抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd2+低質(zhì)量濃度時文蛤鰓上皮細(xì)胞中少數(shù)線粒體內(nèi)嵴斷裂現(xiàn)象，線粒體形狀尚顯規(guī)則，隨著Cd2+染毒質(zhì)量濃度的升高，線粒體體積變大，形狀變形，大多數(shù)嵴逐漸脫落，腫脹和空泡化現(xiàn)象普遍，并出現(xiàn)少量的凝聚現(xiàn)象，但未發(fā)現(xiàn)像泥蚶(Tegillarcagranosa)[1]及美洲牡蠣[23]細(xì)胞中線粒體數(shù)量增多的現(xiàn)象。有研究表明，線粒體的凝聚或腫脹被認(rèn)為是對動物細(xì)胞中重金屬毒性的一種病理反應(yīng)[1,6-7,15,23]。Green等[25]研究表明，細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的破壞可能導(dǎo)致有毒物質(zhì)在線粒體內(nèi)積累，影響線粒體的基本功能，導(dǎo)致細(xì)胞因能量障礙而凋亡。因此，線粒體損傷在細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[17,22,25]。

研究表明，鰓表面的微絨毛能增大上皮細(xì)胞表面積，有利于鰓的呼吸和離子轉(zhuǎn)運的作用[6-7,21,26]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著Cd2+染毒質(zhì)量濃度的升高，鰓絲微絨毛由原來數(shù)量眾多、整齊排列的結(jié)構(gòu)逐漸演變成數(shù)量減少甚至大量脫落的現(xiàn)象。文蛤鰓絲微絨毛數(shù)量的下降可能因為文蛤?qū)χ亟饘俚奈蘸髮?dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，也意味著器官正常的功能可能出現(xiàn)紊亂，包括水過濾不足，氣體交換不足和濾食減少等，這與已有的研究結(jié)果一致[1,5,26 ]。Sunila[26]研究重金屬離子對紫貽貝(Mytilusedulis)的影響時也發(fā)現(xiàn)，在重金屬離子作用下，紫貽貝鰓上皮細(xì)胞腫脹變形，微絨毛空泡化且大量脫落，并認(rèn)為細(xì)胞結(jié)構(gòu)的這些變化可能是一種防御機(jī)制。鰓絲微絨毛主要存在于鰓組織的黏液細(xì)胞和分泌細(xì)胞表面，這些細(xì)胞作為重金屬結(jié)合的一個位點，在重金屬進(jìn)入組織前進(jìn)行捕捉作用，或通過分泌細(xì)胞或其他細(xì)胞驅(qū)逐已吸收的污染物[5,7]。隨著動物長期暴露于重金屬中，鰓絲形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，如上皮細(xì)胞的逐漸壞死、脫落和黏液分泌增加、線粒體空泡化等將反映其分子水平上的紊亂，因此識別這些結(jié)構(gòu)的變化將有助于了解動物對金屬接觸后的早期細(xì)胞反應(yīng)的結(jié)果。