楊世平，周嘉豪，孫成波，曹佩星，王成桂，陳兆明，羅 鵬

( 1.廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088； 2.廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510301 )

近年來(lái)，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展，不少養(yǎng)殖品種均面臨著品種老化和退化、養(yǎng)殖動(dòng)物病害的頻繁發(fā)生、養(yǎng)殖水體環(huán)境的日益惡化三大問(wèn)題，已成為阻礙我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸[1]。蝦池內(nèi)的總氮量約有90%為人工投餌造成，其中只有19%轉(zhuǎn)化為蝦體內(nèi)的氮，有62%～68%的氮沉積于淤泥中，有8%～12%是以溶解氮等形式存在于池水中。這些污染物或沉積到蝦池底部，或直接排入養(yǎng)殖環(huán)境中，導(dǎo)致環(huán)境的污染越來(lái)越嚴(yán)重，養(yǎng)殖過(guò)程中的病害也越來(lái)越難控制[2]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，往往使用消毒劑或抗生素來(lái)進(jìn)行疾病的預(yù)防和控制，造成了生物抗藥性的增加和藥物殘留等問(wèn)題[3]。而微生物制劑的綠色環(huán)保、無(wú)殘留、不產(chǎn)生抗性和作用廣泛等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)代水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素等化學(xué)藥劑最有潛力的替代品[3-5]。同時(shí)，微生物制劑還具有降低水體中氨氮、亞硝酸鹽等有毒物質(zhì)，調(diào)控對(duì)蝦養(yǎng)殖水體水質(zhì)，穩(wěn)定藻相的作用，為對(duì)蝦的養(yǎng)殖成功提供一個(gè)良好的水環(huán)境[6]。

芽孢桿菌(Bacillus)是人類發(fā)現(xiàn)最早的細(xì)菌之一，它在工業(yè)酶、生物防治和微生物添加劑等領(lǐng)域已有很多的研究和應(yīng)用。芽孢桿菌作為一種微生物制劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用已有諸多報(bào)道。具有清除各種有機(jī)污染和氨氮等有毒物質(zhì)的作用，也可產(chǎn)生抗菌素等抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，改善水產(chǎn)動(dòng)物腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，提高免疫力、消化酶活力和成活率等[6-15]。乳酸菌具有產(chǎn)生乳酸、調(diào)節(jié)微生物菌群、維持微生態(tài)平衡等作用[16]。而產(chǎn)乳酸的芽孢桿菌具有乳酸菌和芽孢桿菌的特點(diǎn)，已被用于斷奶仔豬中，能提高斷奶仔豬的日增質(zhì)量和血清中的白蛋白和總蛋白含量，增強(qiáng)仔豬的免疫力[17]。目前，關(guān)于產(chǎn)乳酸芽孢桿菌在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者使用不同密度的產(chǎn)乳酸芽孢桿菌直接投入對(duì)蝦養(yǎng)殖后期水體中，研究其對(duì)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響，以期為產(chǎn)乳酸芽孢桿菌的使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

產(chǎn)乳酸芽孢桿菌由廣東八方生物科技有限公司提供，含量為2.0×1010cfu/g；凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)取自廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物基地，選取(9.0±0.8) cm同一批次健康、活力好的凡納濱對(duì)蝦，暫養(yǎng)3 d 后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

模仿室外池塘養(yǎng)殖，試驗(yàn)在0.3 m3的玻璃鋼桶中進(jìn)行，裝入養(yǎng)殖后期海水200 L，每個(gè)試驗(yàn)桶放入10尾凡納濱對(duì)蝦。試驗(yàn)分為對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組，各組分別投放芽孢桿菌0、0.1、1、10 g，使投放的芽孢桿菌的密度為0、104、105cfu/mL和106cfu/mL，每組設(shè)3個(gè)平行。所有的試驗(yàn)桶均實(shí)行同樣的管理措施。每日測(cè)量一次水質(zhì)和總異養(yǎng)菌、弧菌(Vibrio)以及芽孢桿菌的變化，持續(xù)7 d，期間不進(jìn)行換水處理。試驗(yàn)水體鹽度28，溫度(28±1) ℃，pH 8.0±0.2。

1.3 水樣的采集及指標(biāo)測(cè)定

采樣時(shí)間為每日8:30，采樣后直接帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)定。氨氮采用改良的次溴酸鈉氧化法分光光度法測(cè)定[18]，亞硝酸鹽氮采用鹽酸萘乙二胺分光光度法測(cè)定，硝酸鹽氮采用鋅鎘還原法測(cè)定，活性磷(可溶性活性磷)采用磷鉬藍(lán)法測(cè)定[19]?？偖愷B(yǎng)菌、弧菌及芽孢桿菌分別采用2216E 培養(yǎng)基、硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用稀釋涂布平板法測(cè)定[20]。芽孢桿菌測(cè)定時(shí)，水樣需要80 ℃的水浴20 min。30 ℃恒溫培養(yǎng)24～72 h后，計(jì)數(shù)菌落數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel、SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，并在0.05水平上對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中理化因子的影響

2.1.1 氨氮

圖1 養(yǎng)殖水體中氨氮的變化同一時(shí)間的柱形圖中不同小寫字母表示差異顯著，下同.

試驗(yàn)期間水體中的氨氮含量情況見(jiàn)圖1。投放芽孢桿菌后，104、105cfu/mL密度組水體中氨氮含量先出現(xiàn)增加趨勢(shì)，到第3 d時(shí)，氨氮含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各試驗(yàn)組第6 d和第7 d時(shí)，均出現(xiàn)小幅增加，但投放芽孢桿菌的各試驗(yàn)組水體中氨氮含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.1.2 亞硝酸鹽氮

試驗(yàn)期間水體中的亞硝酸鹽氮含量變化見(jiàn)圖2。同氨氮含量變化一樣，在第4 d時(shí)，各試驗(yàn)組的亞硝酸鹽氮含量均有小幅下降，隨后開(kāi)始上升。至6 d時(shí)，各投放芽孢桿菌的試驗(yàn)組水體中亞硝酸鹽氮含量達(dá)最高，隨后開(kāi)始下降。第7 d時(shí)，投放芽孢桿菌的各試驗(yàn)組水體中亞硝酸鹽氮含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖2 養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽氮的變化

2.1.3 硝酸鹽氮

試驗(yàn)期間水體中的硝酸鹽氮含量變化見(jiàn)圖3。投放芽孢桿菌的各試驗(yàn)組水體中硝酸鹽氮含量變化規(guī)律與氨氮、亞硝酸鹽氮相似。在第4 d時(shí)，各試驗(yàn)組的硝酸鹽氮含量均有小幅下降，但隨后又開(kāi)始增加。除第1 d以外，投放芽孢桿菌的各試驗(yàn)組水體中硝酸鹽氮含量與對(duì)照組間均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖3 養(yǎng)殖水體中硝酸鹽氮的變化

2.2 芽孢桿菌對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中微生物的影響

2.2.1 總異養(yǎng)菌

水體中總異養(yǎng)菌的變化見(jiàn)圖4。各投放芽孢桿菌的試驗(yàn)組總異養(yǎng)菌的密度從試驗(yàn)一開(kāi)始均高于對(duì)照組，到第4 d時(shí)，各投放芽孢桿菌的試驗(yàn)組總異養(yǎng)菌密度達(dá)到最高，且均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。到第5 d后各投放芽孢桿菌的試驗(yàn)組的總異養(yǎng)菌密度開(kāi)始減少。到第7 d時(shí)，只有106cfu/mL密度組的總密度高于對(duì)照組。

2.2.2 弧菌

水體中弧菌的變化見(jiàn)圖5。在投放芽孢桿菌第2 d和第3 d，各投放芽孢桿菌的試驗(yàn)組弧菌密度與總異養(yǎng)菌密度一樣，達(dá)到最高且均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。試驗(yàn)期間僅有第7 d，對(duì)照組弧菌密度顯著高于各投放芽孢桿菌的試驗(yàn)組(P<0.05)。

圖5 水體中弧菌的變化

2.2.3 芽孢桿菌

投放芽孢桿菌的各試驗(yàn)組水體中芽孢桿菌的變化見(jiàn)圖6。投放芽孢桿菌后，各試驗(yàn)組芽孢桿菌的密度呈現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢(shì)，到第4 d時(shí)，各投放芽孢桿菌的試驗(yàn)組芽孢桿菌的密度達(dá)到最高，第4 d后開(kāi)始下降。第6 d時(shí)，各試驗(yàn)組芽孢桿菌的密度差異縮小，105cfu/mL和106cfu/mL間的芽孢桿菌的密度無(wú)顯著差異(P>0.05)。各投放芽孢桿菌組的芽孢桿菌密度在整個(gè)試驗(yàn)期間均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

圖6 水體中芽孢桿菌的變化

3 討 論

3.1 芽孢桿菌對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體理化因子的影響

芽孢桿菌是普遍存在的一類好氣性細(xì)菌[18]，它也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種常見(jiàn)的微生物制劑，可以分解養(yǎng)殖過(guò)程中殘留的各種廢物，有效降低養(yǎng)殖水體中的化學(xué)需氧量和生物需氧量，以及氨氮和亞硝酸鹽氮等有害物質(zhì)的含量，同時(shí)為單細(xì)胞藻類為主的浮游植物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)水質(zhì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的良性生態(tài)循環(huán)[1,6,21-23]。在本試驗(yàn)中，投放芽孢桿菌的各試驗(yàn)組在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽氮的含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明芽孢桿菌能有效去除養(yǎng)殖水體中的氨氮和亞硝酸鹽氮。與使用枯草芽孢桿菌制劑來(lái)改善羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)[24]、鱖魚(yú)(Sinipercachuatsi)[25]等養(yǎng)殖水體水質(zhì)的試驗(yàn)結(jié)果相似。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，在投入芽孢桿菌后的第3 d，104cfu/mL和105cfu/mL試驗(yàn)組的氨氮含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，原因可能為本試驗(yàn)?zāi)M了室外池塘養(yǎng)殖條件，用養(yǎng)殖后期的池塘水作為試驗(yàn)用水，養(yǎng)殖水體中各種有機(jī)廢物的本底含量較高，投入芽孢桿菌后，加速了各種有機(jī)廢物的分解，從而導(dǎo)致氨氮含量的短暫升高。杭小英等[24]研究枯草芽孢桿菌制劑對(duì)羅氏沼蝦養(yǎng)殖池塘水質(zhì)的影響，出現(xiàn)了類似的結(jié)果。這也提示在使用芽孢桿菌等微生物制劑時(shí)，需要長(zhǎng)期有規(guī)律的使用，如果在養(yǎng)殖水體中有機(jī)物積累較多才使用，會(huì)有導(dǎo)致氨氮含量短暫升高的風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 芽孢桿菌對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中微生物的影響

養(yǎng)殖水體中微生物的主要種類包括一些對(duì)水環(huán)境有益的微生物，如芽孢桿菌、亞硝化菌、乳酸桿菌，也包括一些有害的微生物，如副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)等[26]，它們組成了一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡系統(tǒng)，這種平衡一旦被打破，有害細(xì)菌的大量繁殖，就會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖對(duì)象產(chǎn)生疾病。本試驗(yàn)采用對(duì)蝦養(yǎng)殖后期池塘水進(jìn)行試驗(yàn)，水體的總異養(yǎng)菌、弧菌和芽孢桿菌的密度較高，分別達(dá)107～108cfu/mL、104～105cfu/mL和102～104cfu/mL?？偖愷B(yǎng)菌、弧菌的密度與測(cè)定的凡納濱對(duì)蝦苗種淡化期間養(yǎng)殖水體密度相近[27]，高于李卓佳等[20]測(cè)定的高位池養(yǎng)殖水體中的密度。試驗(yàn)中，投入芽孢桿菌后，水體的總異養(yǎng)菌和芽孢桿菌的密度均顯著增加(P<0.05)。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，水體中弧菌的密度也顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明投放的芽孢桿菌能在養(yǎng)殖水體中存活和繁殖，結(jié)合水質(zhì)數(shù)據(jù)指標(biāo)，起到了改善水質(zhì)的作用。但在投入芽孢桿菌后的第2 d和第3 d，水體中弧菌密度卻顯著高于對(duì)照組，與王春迪等[14,28]的研究結(jié)果不同。硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基能夠培養(yǎng)養(yǎng)殖水體中的弧菌，但部分非弧菌的細(xì)菌也能在其上良好生長(zhǎng)[29]。因此，養(yǎng)殖水體的弧菌密度的增加可以有兩個(gè)原因。一是檢測(cè)方法的不準(zhǔn)確，總異養(yǎng)菌的增加，一些非弧菌細(xì)菌因有硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基而生長(zhǎng)。二是因?yàn)楸驹囼?yàn)采用的是養(yǎng)殖后期池塘水作為試驗(yàn)用水，芽孢桿菌的添加，加速水體中有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物的釋放，從而導(dǎo)致弧菌密度的短期升高，具體原因有待進(jìn)一步研究。