李麗霞，劉濟(jì)明，黃小龍，駱 暢，熊 雪，柳嘉佳，鄧明明，李 佳

(貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

米槁(CinnamomummigaoH.W.Li)系樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木[1]，主要分布于云南、貴州和廣西等省(自治區(qū))，垂直分布海拔300～1 000 m[2]。米槁為貴州省地道中藥材，其干燥果實(shí)大果木姜子是貴州十大苗藥之一[3]。除藥用外，米槁還可用作香料和工業(yè)原料，是一種多用植物。趙山等[2]、冉光德[4]、鄭亞玉等[5]認(rèn)為，由于近年來對米槁不合理的亂砍濫伐，加上長期只收不種、不保護(hù)的惡性循環(huán)，以及該物種坐果率低、果實(shí)有大小年之分的自然障礙，致使米槁種群天然更新不良，種群數(shù)量急劇下降。目前有關(guān)米槁的研究主要集中在藥用化學(xué)成分分離與鑒定、化學(xué)成分的生物活性與藥理特性等方面[6-11]，而對其基礎(chǔ)生物特性、生態(tài)特性以及針對其種群退化機(jī)制原因的探究卻鮮有報(bào)道。遺傳多樣性是物種長期進(jìn)化的結(jié)果，是種群生存和發(fā)展的前提，對于米槁等生命周期相對較長的林木植物來說，遺傳多樣性決定了其適應(yīng)能力，是維持森林生態(tài)系統(tǒng)長期穩(wěn)定的基礎(chǔ)[12-13]。分子標(biāo)記是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映，分子標(biāo)記中簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增(Inter-simple sequence repeat,ISSR)結(jié)合了RAPD和SSR的優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、分類、進(jìn)化及遺傳多樣性等方面的研究中，通過分子標(biāo)記可以有效地指示植物的遺傳結(jié)構(gòu)與分化情況，探索植物在物種水平和種群水平的遺傳多樣性情況[14-15]。在米槁具備良好應(yīng)用價(jià)值的情況下，無論是從保護(hù)的角度還是從開發(fā)利用的角度，開展米槁種群生存現(xiàn)狀和遺傳多樣性研究，不僅能為米槁遺傳資源的遺傳改良、有效保護(hù)和合理利用提供理論依據(jù)，還可為米槁種群退化機(jī)制的探討奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料來源于貴州省羅甸縣(LD1、LD2)、冊亨縣(CH)、貞豐縣(ZF)、望謨縣(WM1、WM2)、荔波縣(LB)、鎮(zhèn)寧縣(ZN)的8個(gè)米槁天然種群(表1)，從中采集62株米槁無病蟲害的幼嫩葉片，采集時(shí)間為2016年7-8月。將采摘的米槁新鮮葉片立即放入裝有硅膠的自封袋中，將其帶回實(shí)驗(yàn)室再置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取與檢測 采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取米槁(8個(gè)天然種群62株單株)葉片的DNA，放入-20 ℃保存?zhèn)溆?。用Eppendorf公司的Biophotometer核酸蛋白分析儀檢測所提DNA的含量和純度，用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用G-BOX紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄，檢測DNA品質(zhì)。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增 參照哥倫比亞大學(xué)(UBC)2006年公布的100條ISSR引物序列，由上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成。從100條ISSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的19條引物用于米槁的ISSR分析(引物編號及序列見表2)。反應(yīng)體系總體積為20 μL，包含MgCl21.8 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.7 μmol/L，模板DNA 90 ng，TaqDNA聚合酶1 U。ISSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53.0 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃保存。

表1 米槁采樣地概況Table 1 Description of sampling locations of Cinnamomum migao

1.2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，緩沖液為1×TAE，電壓5 V/cm。在溴酚藍(lán)指示劑距離前沿2～3 cm時(shí)停止電泳，采用G-BOX紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用人工計(jì)帶法判讀電泳圖譜中的擴(kuò)增產(chǎn)物和分子量。相同遷移位置上條帶有或無分別計(jì)為“1”和“0”，構(gòu)成“0，1”矩陣。將每個(gè)位點(diǎn)視為等位基因M和m，數(shù)據(jù)“1”代表基因型MM或Mm，數(shù)據(jù)“0”代表基因型mm，并且假定種群內(nèi)基因頻率處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，用POPGENE32軟件計(jì)算多態(tài)性條帶比例(PPL)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s多樣性指數(shù)(H′)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、基因分化系數(shù)(Gst)、基因流(Nm)、遺傳相似系數(shù)(I)、Nei’s遺傳距離(D)等9個(gè)相關(guān)遺傳參數(shù)[16]。

采用AMOVA1.55軟件對8個(gè)米槁種群62株個(gè)體進(jìn)行遺傳變異的分子方差分析；用NTSYSpc V2.10e軟件對8個(gè)米槁種群采用非加權(quán)算術(shù)平均法(unweighted pair group with arithmetic average,UPGMA)進(jìn)行聚類分析，建立聚類圖；運(yùn)用GenAlEx軟件對62株米槁個(gè)體進(jìn)行主坐標(biāo)軸分析，建立PCoA 散點(diǎn)聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 米槁物種和種群的遺傳多樣性

由表2可知，用19條引物對8個(gè)米槁種群的62株DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出186 條重復(fù)性高的清晰條帶，條帶大小為200～3 000 bp，其中多態(tài)性條帶有167條，多態(tài)性條帶比例為89.78%。平均每個(gè)引物可擴(kuò)增出9條多態(tài)性條帶，其中引物UBC846擴(kuò)增的條帶數(shù)最多(15條)，且擴(kuò)增條帶多態(tài)位點(diǎn)比例高達(dá)100.00%，引物UBC810擴(kuò)增條帶數(shù)最少(6條)。

由表3可知，米槁在物種水平上的多態(tài)性條帶比例(PPL)為90.86%，在種群水平上的PPL平均為57.26%，其中WM1種群的PPL最高，為70.97%，ZN種群的PPL最低，為30.65%。按PPL排序，各個(gè)種群遺傳多樣性高低的順序?yàn)閃M1>LD2=WM2>ZF>LB>CH>LD1>ZN。種群平均觀測等位基因數(shù)(Na)為1.572 6，Na最高的種群為WM1(1.709 7)，最低的種群為ZN(1.306 5)，各種群Na大小順序?yàn)閃M1>WM2=LD2>ZF>LB>CH>LD1>ZN；物種水平Na為1.908 6。種群有效等位基因數(shù)(Ne)平均為1.390 9，最高為 WM1(1.469 6)，最低為ZN(1.245 2)，各種群Ne大小順序?yàn)閃M1>WM2>LB>ZF>LD2>CH>LD1>ZN；物種水平Ne為1.520 9。Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)最高的種群是WM1(0.269 1)，最低的是ZN(0.136 2)，平均為0.223 3，8個(gè)米槁種群H順序?yàn)閃M1>WM2>LB>LD2>ZF>CH>LD1>ZN；物種水平的H為0.303 2。Shannon’s多樣性指數(shù)(H′)種群水平均值為0.328 2，最高的是WM1種群(0.397 4)，最低的是ZN種群(0.195 1)，各種群排序?yàn)閃M1>WM2>LD2>LB>ZF>CH>LD1>ZN。H′物種水平(0.453 9)>種群水平(0.328 2)，H指數(shù)物種水平(0.303 2)>種群水平(0.223 3)，Ne物種水平(1.520 9)>種群水平(1.3909 )，由此可見，米槁物種水平遺傳多樣性較為豐富。

表2 62株米槁單株的ISSR擴(kuò)增結(jié)果Table 2 ISSR amplification of 62 individuals of Cinnamomum migao

表3 8個(gè)米槁天然種群的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of 8 Cinnamomum migao populations

2.2 米槁種群的遺傳結(jié)構(gòu)與分化

利用AMOVA對所有的ISSR標(biāo)記數(shù)據(jù)按種群間、種群內(nèi)兩因素階層進(jìn)行分子方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，米槁總的遺傳變異中有16.14%存在于種群間，83.86%存在于種群內(nèi)(P<0.001)，表明種群間和種群內(nèi)遺傳分化均極顯著，該分析結(jié)果與2.1節(jié)分析結(jié)果相似。

根據(jù)Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)估算的米槁8個(gè)天然種群間的基因分化系數(shù)(Gst)為0.263 6，即表示種群間變異占總遺傳變異的26.36%，種群內(nèi)變異占比為73.64%。根據(jù)Shannon’s多樣性指數(shù)(H′)估算的種群間遺傳多樣性所占比例為27.69%，即表示種群間變異占總遺傳變異的27.69%，種群內(nèi)變異占比72.31%。根據(jù)H′分析的種群間遺傳多樣性占比雖略高于根據(jù)H估算的Gst值，但兩類指數(shù)估算的米槁種群遺傳分化結(jié)果一致，即均以種內(nèi)遺傳變異為主。根據(jù)Gst計(jì)算出的米槁種群水平上的基因流(Nm)為1.396 8。

表4 8個(gè)米槁天然種群的分子方差分析Table 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) for 8 Cinnamomum migao populations

2.3 米槁種群間的遺傳距離和聚類結(jié)果

基因分化系數(shù)(Gst)只能評估種群間的分化程度，不能定量分析種群間的遺傳分化，為了進(jìn)一步分析種群之間的分化程度，利用POPGENE軟件計(jì)算出種群間的遺傳相似系數(shù)(I)和Nei’s遺傳距離(D)，結(jié)果見表5。由表5可知，I在0.785 6～0.954 6，這表明種群間的親緣關(guān)系很近。8個(gè)米槁種群的D都不高，最大的為LD2和ZN兩種群間，但也只有0.241 3，最小的為WM1和WM2兩種群間，僅0.046 4。

表5 8個(gè)米槁天然種群的Nei’s遺傳相似系數(shù)和遺傳距離Table 5 Nei’s genetic identity and genetic distance among 8 Cinnamomum migao populations

注：表中右上部分為遺傳相似系數(shù)(I)，左下部分為遺傳距離(D)。

Note:The data above diagonal are genetic identity (I),while the data below diagonal are the genetic distance (D).

根據(jù)種群間的遺傳相似系數(shù)(I)和Nei’s遺傳距離(D)，使用NTSYSpcV2.10e軟件采用UPGMA法構(gòu)建了米槁種群的遺傳關(guān)系聚類圖，結(jié)果見圖1。由圖1可知，米槁種群間的遺傳距離較小，在遺傳距離0.08處，8個(gè)種群被劃分為2類，即ZN單獨(dú)為一類，其余7個(gè)種群為一類；在遺傳距離0.07處，7個(gè)種群又被劃分為2類，即LD1、LD2、WM1、WM2聚為一類，CH、LB、ZF聚為一類；在遺傳距離0.05處，LB單獨(dú)歸為一類，CH、ZF聚為一類；在距離0.045處，LD1、LD2聚為一類，WM1、WM2聚為一類。

圖1 基于ISSR標(biāo)記的8個(gè)米槁天然種群的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram for 8 natural populations of Cinnamomum migao based on ISSR markers

PCoA散點(diǎn)聚類圖體現(xiàn)了個(gè)體間的遺傳關(guān)系。由圖2可見，62株米槁個(gè)體可明顯分為2個(gè)譜系，譜系1為LD(LD1、LD2)，譜系2包含ZN、ZF、CH、LB，而WM(WM1、WM2)兼具2個(gè)譜系的遺傳信息，個(gè)體之間存在一定差異。

圖2 米槁62株個(gè)體的PCoA散點(diǎn)圖Fig.2 Principal coordinates analysis (PCoA) of 62 samples of Cinnamomum migao

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是物種長期進(jìn)化的產(chǎn)物，也是生存和發(fā)展的前提，遺傳變異大小決定了一個(gè)物種的進(jìn)化潛力和抗逆境能力，遺傳多樣性越豐富，其對環(huán)境變化的適應(yīng)能力越強(qiáng)，分布范圍也就越廣[17]。本試驗(yàn)采用ISSR標(biāo)記對米槁8個(gè)天然種群的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，從條帶檢測結(jié)果可以看出多態(tài)性條帶比例為89.78%。在米槁種群水平上平均Na為1.572 6，Ne為1.390 9，H為0.223 3，H′為0.328 2， PPL為57.26%，米槁不同天然種群各遺傳多樣性指標(biāo)均顯示為物種水平>種群水平，說明米槁物種水平遺傳多樣性較為豐富，進(jìn)一步證實(shí)了陳美蘭等[18]對米槁果實(shí)大果木姜子遺傳多樣性的研究結(jié)論，即認(rèn)為米槁在種群間的遺傳多樣性較低，而在種群內(nèi)的分化較高，大部分變異存在于種群內(nèi)，且種群水平的H指數(shù)(0.223 3)也與陳美蘭等[18]的H指數(shù)(0.228 0)大致相當(dāng)。在物種水平上，與樟科其他植物相比，米槁Shannon’s多樣性指數(shù)為0.453 9，低于孫林[19]用微衛(wèi)星SSR標(biāo)記的天目木姜子(Litseaauriculata)(0.515 0)，高于冷欣等[20]應(yīng)用ISSR標(biāo)記的紅楠(Machilusthunbergii)(0.385)、慈秀芹[21]應(yīng)用RAPD標(biāo)記的思茅木姜子(Litseaszemaois)(0.264 2)、江香梅等[22]應(yīng)用RAPD標(biāo)記的閩楠(Phoebebournei)(0.368 8)和王中生等[23]標(biāo)記的舟山新木姜子(Neolitseasericea)(0.282 0) 。米槁種群平均Shannon’s多樣性指數(shù)H′(0.328 2)高于潘曉華[24]應(yīng)用RAPD標(biāo)記的樟樹(Cinnamomumcamphora)(0.249 6)?？梢?，米槁遺傳多樣性屬于中偏高水平，說明米槁的遺傳多樣性較豐富。

通過對8個(gè)米槁種群的ISSR數(shù)據(jù)進(jìn)行AMOVA分析，表明米槁總的遺傳變異中有16.14%存在于種群間，83.86%存在于種群內(nèi)，種群間和種內(nèi)遺傳分化均極顯著。樟科其他植物的研究結(jié)果表明：天目木姜子(Litseaauriculata)有28.36%的遺傳變異存在于種群間，71.64%的遺傳變異存在于種群內(nèi)[19]；思茅木姜子(Litseaszemaois)表現(xiàn)為27.01%的遺傳變異存在于種群間，72.99%的遺傳變異存在于種群內(nèi)[25]；舟山新木姜子(Neolitseasericea)的總遺傳變異中種群間占36.46%，種群內(nèi)占63.54%[23]。由此可見，米槁種群間的遺傳變異比例較其他樟科植物的低，而種內(nèi)遺傳變異比例較其他樟科植物的高，進(jìn)一步說明米槁遺傳多樣性較為豐富。遺傳分化系數(shù)是判斷遺傳變異的主要來源，米槁基于Nei’s基因多樣性指數(shù)的基因分化系數(shù)Gst為0.263 6，略低于基于Shannon’s多樣性指數(shù)估計(jì)的分化系數(shù)0.276 9，但均說明米槁種群內(nèi)的遺傳多樣性較種群間高，同時(shí)也說明由于地理隔離的存在，米槁種群間存在一定的遺傳分化。

種群間遺傳相似系數(shù)(I)和Nei’s遺傳距離(D)指示8個(gè)米槁天然種群間的遺傳變異程度較低?；蛄?Nm)是影響種群內(nèi)部和種群間遺傳變異程度的重要因素，大的基因流能夠阻止種群間的遺傳分化，基因流大的物種，種群間的遺傳分化小，基因流小的物種，種群間的遺傳分化大[26]。當(dāng)Nm>1時(shí)，說明種群間存在一定的基因流動(dòng)[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，米槁種群水平上的Nm為1.396 8>1，說明米槁種群間存在基因流動(dòng)，種群間的遺傳分化較小，該結(jié)果與本試驗(yàn)所得的種群間、種群內(nèi)的遺傳多樣性和遺傳分化系數(shù)的分析結(jié)果一致。米槁8個(gè)種群62株個(gè)體的PCoA散點(diǎn)聚類圖顯示，62株個(gè)體明顯分為2個(gè)譜系，譜系1為LD的2個(gè)種群，譜系2包含ZN、ZF、CH、LB，WM的2個(gè)種群兼具2個(gè)譜系的遺傳信息，這揭示了2個(gè)遺傳譜系之間可能存在不對稱的基因流。譜系2中6個(gè)種群個(gè)體分布在一個(gè)狹窄區(qū)域，6個(gè)種群個(gè)體各自緊密聚集在一起；而譜系1所有個(gè)體分布在一個(gè)較廣泛的區(qū)域內(nèi)，并且同一種群的個(gè)體都廣泛分布在區(qū)域中，表明譜系1種群中的個(gè)體之間遺傳距離也較大。UPGMA聚類分析結(jié)果基本支持上述結(jié)果，8個(gè)種群劃分為3大類，ZN單獨(dú)為一類，LD 2個(gè)種群和WM 2個(gè)種群聚為一類，CH、LB、ZF聚為一類；LD1與LD2、WM1與WM2、CH與ZF間遺傳距離都較小，遺傳相似度較高。聚類圖顯示地理距離近的種群聚在一起，反映出米槁的遺傳變異與生境有一定的關(guān)系，從米槁種群的空間分布格局來看，種群遺傳變異分布模式基本上與其地理生態(tài)格局一致，這與吳雪琴[28]對觀光木(Micheliaodora)種群遺傳多樣性研究的結(jié)論一致。