盧金霞，何 芳，馮 峰，管翠萍，劉軍紅，周學(xué)章

(1 寧夏大學(xué) 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

奶牛乳房炎又稱奶牛乳腺炎(Bovine mastitis)，是奶牛乳腺受物理、化學(xué)、微生物刺激所發(fā)生的一種炎癥變化，是一種復(fù)雜的乳腺綜合癥，包括乳腺感染、乳腺炎癥、乳房微循環(huán)和免疫障礙等[1-2]，多發(fā)生于產(chǎn)后哺乳期，常可引起奶牛產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)急劇下降甚至失去泌乳能力。在乳腺免疫防御體系中，奶牛乳腺上皮細(xì)胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)具有哨兵作用，其能夠及時(shí)識(shí)別病原菌并釋放細(xì)胞因子，趨化、激活及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮免疫防御功能[3]。隨著人們對(duì)食品安全要求的不斷提高和國(guó)家對(duì)乳制品品質(zhì)更嚴(yán)格的要求，臨床治療乳房炎常用的抗生素由于存在藥物殘留將逐漸被限用或禁用。應(yīng)用中藥治療奶牛乳房炎，已日益為國(guó)內(nèi)外專家所關(guān)注。

苦參堿(Matrine)是豆科植物苦參(SophoraflaescensAit.)的主要有效成分，也存在于苦豆子(S.alopecuroidesL.)、廣豆根(S.subprostrataChun et T.Chen)中?？鄥A具有多種生理學(xué)活性，具有消炎抗菌、抗過(guò)敏、抗心率失常等作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿能顯著降低慢性肝炎患者血清中透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原蛋白和層粘連蛋白的含量，提示苦參堿具有抗炎及抑制肝纖維化的作用[5]。據(jù)報(bào)道，主要成分由丹參、茜草、苦參提取物組成的復(fù)方茜草灌注液對(duì)臨床型乳房炎的療效優(yōu)于抗生素(青霉素鈉+鏈霉素+生理鹽水)[6]。但有關(guān)苦參堿對(duì)體外培養(yǎng)的BMECs增殖、凋亡及抗氧化能力影響的研究未見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行探討，為研制苦參堿制劑及其在奶牛乳房炎防治中的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 細(xì) 胞 BMECs由本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)組織塊培養(yǎng)法分離鑒定所得。

1.1.2 試劑與儀器 (1)試劑。苦參堿(純度99.22%)、二甲基亞砜(DMSO)，購(gòu)自Solarbio公司；胎牛血清，購(gòu)自Gibco公司；雙抗、DMEM/F12培養(yǎng)基，購(gòu)自HyClone公司；氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、孕酮，均購(gòu)自Sigma公司；RNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司； 一氧化氮(NO)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒、AnnexinV/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)于南京凱基生物發(fā)展有限公司。

(2)儀器。SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，HF90CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)，AE2000倒置相差顯微鏡(Motic公司)，TDL-40B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器公司)，CyFlow Cube流式細(xì)胞儀(德國(guó)Partec公司)，680酶標(biāo)儀和IQ5熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)，Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 苦參堿對(duì)BMECs增殖的影響

按1.0×104孔-1的量將BMECs接種到96孔板，分為A、B、C、D和E 5組，每組3個(gè)重復(fù)，分別用含0，25，50，75和100 μg/mL苦參堿的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，于培養(yǎng)的第3，4，5天，棄去培養(yǎng)液，在每孔中加入50 μL 1×MTT，37 ℃孵育4 h后棄去液體，加入DMSO 150 μL/孔，平板搖床搖勻后，用酶標(biāo)儀于490 nm下測(cè)定吸光度(D490 nm)。

1.3 苦參堿對(duì)BMECs完整性和泌乳能力的影響

按7.0×104孔-1的量將BMECs接種到12孔板，分組和處理方法同1.2，于培養(yǎng)的第5天，分別用NO試劑盒、LDH測(cè)試盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO與LDH含量。

1.4 苦參堿對(duì)BMECs凋亡的影響

按1×106孔-1的量將BMECs接種到6孔板，分組和處理方法同1.2，于培養(yǎng)的第5天，采用流式細(xì)胞儀(AnnexinV/PI雙染法)測(cè)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 苦參堿對(duì)BMECs抗氧化能力的影響

按7.0×104孔-1的量將BMECs接種到12孔板，分組和處理方法同1.2，于培養(yǎng)的第5天，用相應(yīng)試劑盒測(cè)定CAT、GSH-Px、SOD活性及MDA含量。

1.6 苦參堿對(duì)BMECs中p53、STAT1、Caspase-3和SOCS3基因mRNA表達(dá)水平的影響

以β-actin為內(nèi)參基因，采用real-time PCR法檢測(cè)苦參堿對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞p53、STAT1、Caspase-3、SOCS3基因mRNA表達(dá)水平的影響。參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)p53、STAT1、Caspase-3、SOCS3、β-actin基因的real-time PCR引物，引物序列見(jiàn)表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 p53、STAT1、Caspase-3和SOCS3的引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度Table 1 Primers and product lengths of p53,STAT1,Caspase-3 and SOCS3 gene

按1.0×106孔-1將BMECs接種到6孔板，處理方法同1.2，培養(yǎng)5 d后，嚴(yán)格按照天根總RNA提取試劑盒的說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，使用Nano Drop儀器測(cè)定總RNA濃度和純度后，采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。嚴(yán)格按照Takara試劑盒說(shuō)明書(shū)，配制20 μL real-time PCR反應(yīng)體系：SYBR預(yù)混合試劑Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus) 2×10 μL，10 μmol/L PCR正向引物0.8 μL，10 μmol/L PCR反向引物0.8 μL，cDNA模板2 μL，滅菌蒸餾水6.4 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s；65 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在伯樂(lè)iQ5 real-time PCR System實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；采用SPSS 17.0單因素方差分析(ANOVA)法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦參堿對(duì)BMECs增殖的影響

由圖1可知，培養(yǎng)第3天，B～E組BMECs的增殖水平均低于A組，其中C、D、E組與A組差異極顯著(P<0.01)；培養(yǎng)第4天，B、C、D、E組BMECs細(xì)胞增殖水平與A組相比無(wú)顯著性差異；培養(yǎng)第5天，B、C組細(xì)胞增殖水平高于A組，其中B組與A組差異極顯著(P<0.01)，D、E組細(xì)胞增殖水平略低于A組，說(shuō)明低質(zhì)量濃度(25和50 μg/mL)苦參堿對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，而高質(zhì)量濃度(75和100 μg/mL)苦參堿對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用。

2.2 苦參堿對(duì)BMECs完整性和泌乳能力的影響

LDH是機(jī)體能量代謝過(guò)程中的重要酶，能催化乳酸脫氫生成丙酮酸，一般存在于細(xì)胞漿內(nèi)，細(xì)胞膜受損時(shí)則會(huì)溢出胞外至培養(yǎng)上清中[8]。由圖2可知，B～E組BMECs上清液中NO水平均高于A組，其中C組極顯著高于A組(P<0.01)，表明苦參堿可以提高BMECs的泌乳性能；B、C、D和E組BMECs細(xì)胞上清液中的LDH水平均比A組的高，其中B、D組極顯著升高(P<0.01)，C組顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明苦參堿對(duì)細(xì)胞的完整性有一定的破壞作用。

2.3 苦參堿對(duì)BMECs凋亡率的影響

由圖3可知，不同劑量的苦參堿作用于BMECs后，對(duì)細(xì)胞的凋亡率有不同程度的影響，B、C、D、E組BMECs的凋亡率均極顯著高于A組(P<0.01)，其中B組細(xì)胞凋亡率最高。

與A組比較，*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同Compared to group A,* indicates significant difference (P<0.05) and ** indicates extremely significant difference (P<0.01).The same below圖1 苦參堿對(duì)BMECs增殖的影響Fig.1 Effects of matrine on proliferation of BMECs

圖2 苦參堿對(duì)BMECs培養(yǎng)上清液中NO和LDH含量的影響Fig.2 Effects of matrine on NO and LDH contents in culture supernatant of BMECs

2.4 苦參堿對(duì)BMECs抗氧化能力的影響

由圖4可知，B、C、D、E組BMECs的CAT活性均較A組高，其中C組極顯著升高(P<0.01)；B、C、D、E組的GSH-Px活性均極顯著高于A組(P<0.01)；除C組外，B、D和E組的SOD活性隨著苦參堿質(zhì)量濃度增加而明顯升高，其中E組極顯著升高(P<0.01)；B、C和D組的MDA含量較A組下降。綜上可知，苦參堿可提高BMECs的抗氧化能力。

圖4 苦參堿對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of matrine on antioxidant ability of BMECs

2.5 苦參堿對(duì)BMECs中p53、Caspase-3、SOCS3和STAT1基因mRNA表達(dá)的影響

由圖5可知，B～E組的Caspase-3基因相對(duì)表達(dá)量均高于A組，其中B、D、E組極顯著高于A組(P<0.01)；B、C、D組的p53基因相對(duì)表達(dá)量極顯著高于A組(P<0.01)，而E組略低于A組；苦參堿對(duì)各組細(xì)胞的STAT1基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響；B、C、D和E組的SOCS3基因相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于A組(P<0.01)。上述結(jié)果說(shuō)明，苦參堿可上調(diào)Caspase-3、p53和SOCS3基因的表達(dá)量。

圖5 苦參堿對(duì)BMECs中Caspase-3、p53、STAT1和SOCS3基因mRNA表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of matrine on expressions of Caspase-3,p53,STAT1 and SOCS3 mRNA of BMECs

3 討 論

BMECs是奶牛機(jī)體與外界直接接觸的細(xì)胞，作為乳腺防御病原菌入侵的第一道防線，其數(shù)量大大超過(guò)其他參與抵御入侵病原菌的免疫細(xì)胞，在免疫防御過(guò)程中具有十分重要的作用。細(xì)胞增殖和凋亡間的動(dòng)態(tài)平衡是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要方式[9]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，苦參堿作用于BMECs第5天時(shí)，低劑量(25和50 μg/mL)藥物既可促進(jìn)細(xì)胞增殖又可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，高劑量(75和100 μg/mL)苦參堿可抑制細(xì)胞增殖而促進(jìn)細(xì)胞凋亡?？鄥A在低劑量時(shí)既可促進(jìn)細(xì)胞增殖又可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，原因可能為在此質(zhì)量濃度下，苦參堿對(duì)細(xì)胞增殖的影響強(qiáng)于苦參堿對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，綜合表現(xiàn)為苦參堿促進(jìn)細(xì)胞增殖；而在高質(zhì)量濃度時(shí)，苦參堿既可抑制細(xì)胞增殖又可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，綜合表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖。隨著泌乳期的改變，乳腺中NO的含量會(huì)發(fā)生變化，其含量在泌乳前期與妊娠后期達(dá)到最大，可見(jiàn)NO對(duì)促進(jìn)泌乳具有重要作用[7]。在本試驗(yàn)中苦參堿提高了細(xì)胞的NO含量，表明其可以提高BMECs的泌乳性能。

在機(jī)體氧化反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生具有傳遞能量等作用的自由基，但是機(jī)體內(nèi)的自由基應(yīng)在合適的范圍內(nèi)，過(guò)多或者過(guò)少都會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害。這些自由基具有強(qiáng)氧化作用，會(huì)對(duì)機(jī)體在組織水平、細(xì)胞水平或分子水平產(chǎn)生損傷與破壞，最終導(dǎo)致疾病與衰老的發(fā)生[10]。GSH-Px、CAT與SOD是生物機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，在清除自由基、H2O2和過(guò)氧化物以及減少羥基自由基形成等方面發(fā)揮著非常重要的作用[11-12]。MDA是自由基對(duì)不飽和脂肪酸引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物，其含量的多少間接反映了細(xì)胞內(nèi)自由基的量。因此，通過(guò)測(cè)定機(jī)體SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量，在一定程度上可以反映機(jī)體的抗氧化能力[13]。本研究結(jié)果顯示，苦參堿可提高BMECs的SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量，表明苦參堿可提高細(xì)胞的抗氧化能力。

Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞的增殖抑制呈量-效關(guān)系和時(shí)-效關(guān)系，當(dāng)苦參堿質(zhì)量濃度為200 μg/mL且作用于細(xì)胞3 d后，細(xì)胞增殖速度明顯減緩；當(dāng)苦參堿質(zhì)量濃度小于200 μg/mL時(shí)，對(duì)人紅白血病K562細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用；當(dāng)苦參堿質(zhì)量濃度大于200 μg/mL且作用2 d時(shí)，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺傷力。周喜漢等[15]發(fā)現(xiàn)，500～2 000 μg/mL的苦參堿對(duì)結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，25～100 μg/mL苦參堿作用3 d時(shí)，BMECs的增殖受到抑制；25～50 μg/mL苦參堿作用5 d時(shí)，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但當(dāng)質(zhì)量濃度在75～100 μg/mL時(shí)可抑制細(xì)胞的增殖，且與苦參堿質(zhì)量濃度呈負(fù)相關(guān)。綜上所述，在進(jìn)行體外試驗(yàn)時(shí)，不同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的苦參堿對(duì)不同細(xì)胞作用不同，提示在臨床上治療奶牛乳房炎時(shí)應(yīng)選擇合適的苦參堿質(zhì)量濃度，即選擇既能促進(jìn)正常細(xì)胞增殖，又可誘導(dǎo)病變細(xì)胞凋亡的苦參堿質(zhì)量濃度。

凋亡是一個(gè)蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是介導(dǎo)此過(guò)程的重要成分，其可分為執(zhí)行者(包括Caspase-3、6、7)和啟動(dòng)者(包括Caspase-8、9、10)，其中Caspase-3、6、7具有直接降解胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白從而引起凋亡的作用，但是它們不可通過(guò)自催化或自剪接的方式激活；而Caspase-8、9、10在接受到信號(hào)刺激后能通過(guò)自剪接而激活，從而引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16-17]。Caspase-3是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，細(xì)胞凋亡的最后通路均與Caspase-3的活化有關(guān)[18]。p53調(diào)控一些僅有BH3區(qū)域的蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能十分顯著[19-20]。p53與STAT1在生物體內(nèi)對(duì)于細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡有重要作用，且都能抑制細(xì)胞的癌變[7]。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白-3(SOCS3)具有負(fù)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和激素(包括LIF、IL-11、生長(zhǎng)激素、胰島素和瘦素)產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的作用，這些信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的作用就涉及到了控制炎癥過(guò)程、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育等方面[21]。已有研究證實(shí)，SOCS3可以抑制LPS、LIF、IL-2、IL-3、IL-4、IFN-γ和IFN-α產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)通路[22]?？傮w而言，SOCS3具有抑制和阻斷信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用。在本試驗(yàn)中，苦參堿上調(diào)了Caspase-3、p53、SOCS3的表達(dá)，表明其可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)。