黃海劍，張寶琴1,

(1海南大學(xué) 熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228；2浙江大學(xué) 昆蟲科學(xué)研究所，浙江 杭州 310058)

桿狀病毒(baculovirus)是一類含有囊膜結(jié)構(gòu)的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，是目前發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的昆蟲病毒，在害蟲生物防治中發(fā)揮著重要的作用[1]。桿狀病毒根據(jù)其包涵體形態(tài)可分為核型多角體病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV)和顆粒體病毒(Granuclovirus，GV)，其中GV病毒的包涵體呈橢圓形的顆粒狀，常常只包埋單個(gè)病毒粒子，可以在環(huán)境中長期穩(wěn)定存在[2]。近年來，隨著桿狀病毒基因組測序的完成，越來越多的研究者從分子水平揭示了病毒編碼蛋白的功能，為病毒的合理利用提供了理論指導(dǎo)。

菜粉蝶顆粒體病毒(PierisrapaeGranulovirus，PrGV)屬于桿狀病毒科顆粒體病毒屬，是一類特異侵染菜粉蝶的GV病毒，其宿主菜粉蝶(Pierisrapae)屬鱗翅目，幼蟲稱菜青蟲，嚴(yán)重危害甘藍(lán)、蘿卜、花菜等十字花科作物，影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。PrGV基因組大小為108 592 bp，預(yù)測編碼框?yàn)?20個(gè)，占整個(gè)基因組的91%[4]。蛋白同源性比對發(fā)現(xiàn)，有33個(gè)PrGV基因只存在于GV基因組，但在NPV基因組并不存在，這其中包括1個(gè)編碼多角體膜蛋白(polyhedron envelope protein，PEP)的ORF20[5]。有研究表明，PEP是顆粒體囊膜蛋白成分之一，可能參與顆粒體的形成[6-7]。然而，關(guān)于該蛋白在病毒侵染、組裝、擴(kuò)散等生命過程中的作用尚不清楚。

本研究對PrGV PEP進(jìn)行原核表達(dá)，并制備了該蛋白的多克隆抗體，通過表達(dá)時(shí)相分析、免疫標(biāo)記、細(xì)胞定位等手段對PrGV PEP進(jìn)行深入研究，旨在為進(jìn)一步了解PrGV的生物學(xué)特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菜青蟲飼養(yǎng) 試驗(yàn)用菜青蟲和甘藍(lán)植株采自浙江大學(xué)紫金港校區(qū)，并在人工氣候環(huán)境下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度控制在(26±0.5) ℃，相對濕度控制在(50±5)%，光周期(白天/黑夜)為16 h/8 h。

1.1.2 PrGV病毒 PrGV純病毒由浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所分子昆蟲研究室提供。取新鮮的甘藍(lán)葉片，裁成1 mm×2 mm的碎片，將含有PrGV病毒的溶液稀釋100倍，用毛筆均勻涂抹于葉片表面，置容積為1 cm3的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)自然晾干；然后放入剛蛻皮并饑餓3 h的2齡菜青蟲幼蟲。放入1 h后，將完全取食完葉片的幼蟲，即感染PrGV幼蟲，放入新鮮(不含病毒)的甘藍(lán)葉片上繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取與定量PCR 分別挑取感染PrGV后第0，3，6，12，18，24，36，48，72和96 h的菜青蟲若蟲，利用RNAiso plus(TaKaRa，Dalian，China)提取RNA ;隨后，按照ReverTra Ace qPCR RTMaster 試劑盒(ToYoBo，Osaka，Japan)說明書，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；定量PCR按照SYBR Green試劑盒(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)說明書配置反應(yīng)體系，并利用CFX Connect Real-Time System(Bio-Rad)實(shí)時(shí)檢測熒光信號。定量PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共循環(huán)40次。以P.rapae18S rRNA作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt法進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算[8]。共進(jìn)行3個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)生物重復(fù)包含3個(gè)技術(shù)重復(fù)，定量引物設(shè)計(jì)詳見表1。

1.2.2 PEP原核表達(dá) 根據(jù)PrGV PEP編碼蛋白的CDs序列，設(shè)計(jì)1對含有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的PrGV PEP-sense和PrGV PEP-antisense引物(表1)，利用PCR擴(kuò)增目的片段并與PMD-19T(TaKaRa)連接；測序正確后分別用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切PEP-PMD-19T，與經(jīng)同樣雙酶切的pGEX-4T-2表達(dá)載體(Pharmacia，Piscataway，NJ，USA)相連接，獲得PEP-pGEX-4T-2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coliBL21；挑取單菌落接種到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中；加入IPTG至終濃度1 mmol/L ，37 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)6 h；最后，通過SDS-PAGE將誘導(dǎo)表達(dá)得到的菌液進(jìn)行分離，確定目的蛋白的表達(dá)情況。

表1 定量PCR和原核表達(dá)引物及其序列Table 1 Primers and sequences used in prokaryotic expression and quantitative real-time PCR

1.2.3 PEP-GST重組蛋白回收與多克隆抗體制備 將誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并用預(yù)冷的0.25 mol/L KCl溶液染色后切取目的條帶；樣品經(jīng)電泳、脫鹽、濃縮等處理后送至華安生物有限公司(Huaan Biotech，Hangzhou，China)制備PrGV PEP多克隆抗體。

多克隆抗體制備選取健康的新西蘭大耳白兔，分5次免疫，每次蛋白用量為0.5 mg/只：第1次將純化蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，皮下免疫大白兔；第2～5次免疫使用純化蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合液，每次免疫間隔14 d。最后一次免疫后10 d取少量血清，利用ELISA測定抗體效價(jià)，檢測合格后采用頸動脈放血法大量收集兔血，3 000 r/min離心15 min后所得的血清即為抗血清，于-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 PEP的Western blotting檢測 取感染PrGV后剛死亡的菜青蟲，在RIPA裂解液(Beyotime Biotechnology，Beijing，China)中研磨；利用SDS-PAGE分離蛋白后，將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜；PVDF膜經(jīng)1×TTBS(2.42 g Tris-base，8 g NaCl，體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween，pH 7.6，定容到1 L)沖洗1遍后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，并按1∶2 000的體積比加入PrGV PEP多克隆抗體，4 ℃孵育過夜；PVDF膜經(jīng)1×TTBS洗滌3遍后，按照1∶15 000的體積比加入羊抗兔二抗(Jackson Immuno Research，West Grove，PA，USA)，4 ℃封閉過夜；取出PVDF膜，用1×TBS(2.42 g Tris-base，8 g NaCl，pH 7.6，定容到1 L)洗滌3遍；隨后，向PVDF膜加入Clarity western ECL substrate(Bio-Rad)，利用Molecular Imager?ChemiDocTM XRS+System(Bio-Rad)拍攝圖像。

1.2.5 PEP的免疫金標(biāo)記 利用蔗糖密度梯度離心法純化PrGV病毒樣品，將其浸泡在固定液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛，體積分?jǐn)?shù)0.3%戊二醛，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%蔗糖)中；樣品經(jīng)1×PBS洗滌后，分別用體積分?jǐn)?shù)50%，70%，80%，90%，95%和100%的乙醇脫水；脫水后的樣品在Lowicryl K4M(Polysciences，Inc.，Warrington，PA，USA)中浸泡，并放入裝有紫外燈的-20 ℃冰箱中；將聚合后的樣品在LKB Bromma 11800 pyramitome切片機(jī)下進(jìn)行定位，隨后用裝有鉆石刀的Powertome-PC超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片。

將含有超薄切片的銅網(wǎng)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% BSA封閉，并按1∶200體積比加入PrGV PEP多克隆抗體，室溫下孵育2 h；經(jīng)1×PBS洗滌后，按1∶200體積比加入帶有金標(biāo)記的羊抗兔二抗(Sigma，St.Louis，MO，USA)；樣品經(jīng)1×PBS洗滌后，用堿性檸檬酸鉛染色并在JEM-1230 TEM(JEOL，Tokyo，Japan)下觀察。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 利用SMART(http://smart.embl.de/)分析序列結(jié)構(gòu)域；利用鄰接法(MEGA5.0，http://www.megasoftware.net/)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹分析基因間關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系用自舉法檢測1 000次；利用PrGV PEP序列在NCBI上搜索同源基因，并用Clustal X 1.81軟件進(jìn)行多序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEP的序列分析

PrGVPEP基因的核苷酸和氨基酸序列見圖1。

灰色部分為PEP保守結(jié)構(gòu)域 The grey shading indicates the conserved domain of PEP圖1 PrGV PEP基因的核苷酸和氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequence analysis of PrGV PEP

根據(jù)基因組測序結(jié)果(圖1)，獲得編碼框總長為615 bp的PEP基因序列，該基因位于PrGV基因組13 806-14 420 nt，共編碼304個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量大小為23 ku，等電點(diǎn)為7.942。SMART預(yù)測結(jié)果表明，該基因包含1個(gè)PEP保守結(jié)構(gòu)域，位于第16-121個(gè)氨基酸。

利用BLAST軟件搜索PEP的同源序列，發(fā)現(xiàn)PrGV PEP與鱗翅目昆蟲的GV PEP有較高的同源性，氨基酸序列相似性約為50%。然而，PrGV PEP與其他核型多角體病毒(NPV)的基因組序列并無同源性，可能是GV所特有的。進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖2)表明，侵染昆蟲GV的PEP可分為2組：木薯天蛾顆粒體病毒EeGV、稻縱卷葉螟顆粒體病毒CmGV、馬鈴薯麥蛾顆粒體病毒PoGV、菜粉蝶顆粒體病毒PrGV、小菜蛾顆粒體病毒PxGV、地老虎顆粒體病毒AsGV、分月扇舟蛾顆粒體病毒CaGV等為一組；斜紋夜蛾顆粒體病毒SlGV、草地貪夜蛾顆粒體病毒SfGV、一點(diǎn)粘蟲顆粒體病毒MuGV、一星粘蟲顆粒體病毒PuGV、棉鈴蟲顆粒體病毒HaGV等為另一組。其中，PrGV PEP與PxGV PEP的親緣關(guān)系最近，該結(jié)果從側(cè)面反映了GV與宿主之間的演化關(guān)系。

圖2 基于鄰接法構(gòu)建的PEP蛋白種系發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic analysis of PEP using Neighbor-joining method

2.2 PEP的表達(dá)時(shí)相分析

利用定量PCR方法實(shí)時(shí)監(jiān)測PEP基因的增長動態(tài),結(jié)果(圖3)表明，菜青蟲在感毒后0～18 h檢測不到PEP的表達(dá)。隨著感染時(shí)間的推移，感毒菜青蟲體內(nèi)的PEP含量逐漸升高，在感染72 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后開始下降，感染后96 h的表達(dá)量下降到與36 h近似水平。

圖3 PrGV感染后PEP基因表達(dá)水平Fig.3 Expression of PrGV PEP after PrGV

2.3 PEP的原核表達(dá)

將PrGV PEP構(gòu)建到pGEX-4T-2載體，并導(dǎo)入E.coliBL21進(jìn)行原核表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果(圖4)表明，導(dǎo)入pGEX-4T-2的空載體能夠誘導(dǎo)表達(dá)出26 ku的條帶，而未加IPTG誘導(dǎo)的E.coliBL21無法表達(dá)外源蛋白。PrGV PEP能在E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)，其與GST的融合蛋白分子量大小為49 ku，與預(yù)測的蛋白分子量相近。與E.coliBL21自身的蛋白相比較，PrGV PEP融合蛋白的表達(dá)量較高，可以進(jìn)行蛋白回收。

2.4 PEP的Western blotting檢測

將回收的PrGV PEP-GST蛋白免疫健康的新西蘭大耳白兔，最終獲得PrGV PEP多克隆抗體。為檢測這些抗體的特異性，用Western blotting方法雜交PrGV提取物中的目的蛋白。結(jié)果(圖5)表明，在23 ku和15 ku附近均有特異性條帶，并且2條條帶亮度相近。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.未加IPTG誘導(dǎo)的E.coli BL21；2.含有pGEX-4T-2質(zhì)粒的E.coli BL21誘導(dǎo)表達(dá)GST；3.含有PEP-pGEX-4T-2重組質(zhì)粒的E.coli BL21誘導(dǎo)表達(dá)PrGV PEP-GSTM.Protein Marker;1.E.coli BL21 sample without induction ofIPTG;2.Induction of E.coli BL21 with pGEX-4T-2 plasmid; 3.Induction of E.coli BL21 with PEP-pGEX-4T-2 plasmid圖4 PrGV PEP-GST融合表達(dá)分析Fig.4 Expression of PrGV PEP-GST in E.coli BL21

2.5 PEP的免疫金標(biāo)記分析

為探究PrGV PEP在病毒顆粒體上的具體位置，用膠體金標(biāo)記的方法對該蛋白進(jìn)行定位分析,結(jié)果見圖6。

A、B.PrGV PEP多克隆抗體為一抗標(biāo)記PrGV包涵體；C.清水為一抗標(biāo)記PrGV包涵體；D.兔陰性血清為一抗標(biāo)記PrGV包涵體Immunolabelling using anti-PrGV PEP serum (A，B),water (C),and preimmune serum (D) as primary antibodies,respectively

電鏡結(jié)果顯示：PrGV PEP抗體能夠特異地與顆粒體結(jié)合，10 nm的金顆粒遍布整個(gè)病毒粒子，而無病毒粒子的地方則未見金顆粒存在(圖6-A，B)。平均每個(gè)顆粒體上有20～40個(gè)金顆粒，說明PrGV PEP在病毒上的含量較高。相比之下，以清水或以兔陰性血清為一抗的對照組未觀察到標(biāo)記的金顆粒(圖6-C，D)，說明該抗體具有非常高的特異性。

3 討 論

本研究利用制備的PEP多克隆抗體，在感染PrGV的菜青蟲體內(nèi)成功檢測到目的蛋白；通過免疫金標(biāo)記，將PEP定位到包涵體上，發(fā)現(xiàn)該蛋白在顆粒體上含量很高，分布較為均勻，說明PEP是GV包涵體的重要組分；菜青蟲感染PrGV后，其體內(nèi)PEP基因表達(dá)水平逐漸上升，并在感染72 h時(shí)達(dá)到峰值。桿狀病毒包含雙相生活循環(huán)，即在侵染初期產(chǎn)生出芽型病毒(budded virus，BV)，引起宿主整體感染，而在侵染后期產(chǎn)生多角體衍生病毒(occlusion-derived virus，ODV)釋放到周圍環(huán)境[9]。PEP基因在侵染后期表達(dá)量較高，說明該基因很可能是PrGV后期表達(dá)的重要基因。

迄今為止，對桿狀病毒的研究主要集中在NPV上[10-15]，而對GV的研究相對較少，且多集中在對病毒株的報(bào)道[16-21]。其中關(guān)于PrGV的研究報(bào)道涉及基因組[5]和個(gè)別功能基因[22-23]，但對于PEP基因尚未見報(bào)道。本研究對GV特有基因PEP的進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)模式、細(xì)胞定位等進(jìn)行具體分析，為深入研究該基因功能及PrGV的功能基因組學(xué)奠定了基礎(chǔ)。PEP是桿狀病毒的重要組成部分，廣泛存在于NPV和GV中[16,18-21]。PEP主要分布于電子致密的膜上，包裹病毒的蛋白基質(zhì)[24]。王利群等[25]通過對不同NPV多角體膜蛋白的分析發(fā)現(xiàn)，這些序列之間的同源性遠(yuǎn)低于多角體蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，PrGV與其他昆蟲GV PEP氨基酸序列的相似性只有50%左右，說明不同GV的PEP也存在一定差異，這可能與GV的宿主特異性相關(guān)。而PrGV的PEP與NPV則無同源性，這可能是病毒長期進(jìn)化過程中形成的[18-21]。

利用PrGV PEP的多克隆抗體，在PrGV提取物中分別檢測到23 ku和15 ku 2條特異性條帶，類似的現(xiàn)象也在ODV-E18、ODV-EC27等基因中觀察到[5]。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠進(jìn)行蛋白切割、甲基化、糖基化等翻譯后加工過程，如甜菜夜蛾多角體病毒SeMNPV的外殼融合蛋白，在成熟過程中可產(chǎn)生76 ku的原始蛋白和60 ku的切割產(chǎn)物[26-27]。PrGV PEP預(yù)測分子量大小為23 ku，猜測15 ku的條帶可能是成熟蛋白被切割后的產(chǎn)物。

隨著很多病毒新株系被報(bào)道及一些基因功能被逐步解析明確[28-29]，桿狀病毒不僅非常成功地應(yīng)用于生物防治[30-31]，也為人們深入了解這些微生物與宿主的相互影響提供了可能[32]，而PrGV PEP的獨(dú)特性有可能為解釋GV一類微生物的奧秘提供了重要線索。