邢家領(lǐng), 蘇俊琪, 高恩軍

(沈陽化工大學 應(yīng)用化學學院 遼寧省無機分子基化學重點實驗室, 遼寧 沈陽 110142)

腫瘤是影響人類健康的主要惡性疾病,列人類死亡的第一位[1-2].順鉑作為臨床藥物對多種腫瘤的治療具有優(yōu)良的效果,具有廣譜性特點,成為治療腫瘤患者的一線藥物[3].該藥物盡管具有優(yōu)越性,但由于其低溶解性、高腎毒性并伴發(fā)惡心嘔吐等不良癥狀,仍需對其結(jié)構(gòu)進一步修飾或采取藥物載體改善其不足.目前,就藥物載體而言,主要有二氧化硅、環(huán)糊精和磁性氧化鐵等[4-5].碳酸鎂和氫氧化鎂作為典型的食藥級材料,是基于兩種物質(zhì)合適的粒徑尺寸和豐富的比表面積.本文采用化學合成新方法,制備了符合于碳酸鎂和氫氧化鎂食藥級國家標準的兩種生物載藥材料,通過熒光倒置顯微成像技術(shù)、流失細胞手段和MTT酶標比色法測定了“載體-順鉑”對細胞的誘導凋亡能力和細胞活性劑量IC50值,通過熒光光譜學手段測定了藥物復合體與靶向DNA之間的相互作用,得到了有價值的實驗信息.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

實驗所需的順鉑由專業(yè)藥廠提供.菱鎂礦石取自遼寧丹東某礦山.硫代亞硫酸鈉、硫化鈉為AR級試劑.HeLa細胞由本實驗室傳代培養(yǎng)符合測定條件,CT-DNA為生化級試劑.

島津UV2550型紫外分光光度計,XD30A-RFL型熒光倒置顯微鏡,BD Accuri型流式細胞儀,ST-360型酶標儀,Perkin-Elmer LS55型熒光分光光度計,WP-RH-6100型多位平行反應(yīng)合成儀.

1.2 碳酸鎂和氫氧化鎂的制備

按化學反應(yīng)方程式摩爾配比,用精度±0.000 1的電子天平準確稱取一定量的菱鎂礦石,碎化成精細粉末,投入到多位平行反應(yīng)合成儀燒瓶中,加水過程通入CO2至反應(yīng)完全,生成碳酸氫鎂,在反應(yīng)后期加入已知少許準確劑量的硫代亞硫酸鈉和硫化鈉,溶液中的Fe3+還原成Fe2+,生成黑色FeS沉淀,該沉淀物具有豐富的比表面積，吸附了反應(yīng)體系中的無機雜質(zhì).過濾后將所得濾液在95 ℃烘箱中烘干,得到優(yōu)質(zhì)碳酸鎂樣品,符合國家食藥級標準GB 25587-2010.根據(jù)衛(wèi)生部藥品標準(二部)第五冊所提供的檢驗方法對樣品進行檢測,測試結(jié)果:樣品為白色粉末無味,氧化鎂42.11 %(質(zhì)量分數(shù)),氯化物0.02 %(質(zhì)量分數(shù)),硫酸鹽0.43 %(質(zhì)量分數(shù)),氧化鈣0.31 %(質(zhì)量分數(shù)),可溶性鹽類0.85 %(質(zhì)量分數(shù)),重金屬(以Pb計)8 μg/g,樣品適合醫(yī)藥實驗.將上述所得合格的碳酸鎂樣品在550 ℃下熱解2 h,得到達到食藥級指標要求的氫氧化鎂,符合國家藥品標準(WS-10001-(HD-0539)-2002).測試結(jié)果：樣品為白色粉末，氯化物0.02 %(質(zhì)量分數(shù))，硫酸鹽0.43 %(質(zhì)量分數(shù))，鈣1.3 %(質(zhì)量分數(shù))，可溶性鹽類0.85 %(質(zhì)量分數(shù))，重金屬(以Pb計)8 μg/g,樣品適合醫(yī)藥實驗.

1.3 碳酸鎂和氫氧化鎂負載順鉑實驗

分別稱取準確劑量的碳酸鎂和氫氧化鎂粉末,與準確劑量的順鉑混合研磨,用水做分散劑,超聲震蕩至溶液分散均勻.用紫外分光光度計檢測碳酸鎂和氫氧化鎂的載藥含量和包封率[6-9],計算得到碳酸鎂的載藥量為30.32 %(質(zhì)量分數(shù)),包封率為70.25 %(質(zhì)量分數(shù));氫氧化鎂的載藥量為31.56 %(質(zhì)量分數(shù)),包封率為71.76 %(質(zhì)量分數(shù)),達到了載藥要求.

1.4 熒光倒置顯微鏡測定細胞凋亡實驗

將負載藥物與HeLa細胞在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗,用FITC和PI進行染色,在倒置熒光顯微鏡上成像,觀察細胞的形態(tài)學變化[10].

1.5 流式細胞法測定細胞凋亡實驗

應(yīng)用流式細胞儀測定負載藥物的實驗過程與1.4的實驗操作相似,凋亡成像圖形由四組象限表達[11].

1.6 MTT法測定藥物對細胞的半數(shù)抑制濃度

負載藥物在使用前配制成所需濃度溶液,用細胞培養(yǎng)液稀釋成0.4、1.2、3.6、11、33 mg/L 五個質(zhì)量濃度,將藥物與HeLa細胞置于96孔培養(yǎng)板上,培養(yǎng)24 h后,每孔加入20 μL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,每孔加入100 μL二甲基亞砜,震蕩10 min使甲瓚充分溶解,最后使用酶標儀在波長為490 nm處檢測吸光值,通過GraphPad Prism 5軟件計算得到藥物對HeLa細胞的IC50值[12].

1.7 藥物與DNA相互作用的熒光猝滅實驗

將2 mL濃度為5×10-5mol·L-1的DNA溶液與0.4 mL溴化乙錠(EtBr)溶液避光反應(yīng)2 h,加入定量的負載藥物置于pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液中,定容到20 mL,繼續(xù)避光靜置2 h.在激發(fā)波長λex=526 nm下,檢測發(fā)射波長λem=615 nm處的熒光猝滅曲線[13].

2 結(jié)果與討論

2.1 藥物的細胞凋亡效果

細胞凋亡是細胞死亡的另一種形式,是多種基因參與并由多種信號傳遞途徑介導的程序化主動死亡過程,許多化療藥物的抗癌效果與誘導腫瘤細胞凋亡的能力相關(guān),已成為評價抗癌藥物的重要指標[14].圖1為不同倍數(shù)下“載體-藥物”與HeLa細胞作用12 h后的細胞凋亡效果圖.

圖1 不同倍數(shù)下的細胞凋亡形態(tài)Fig.1 Apoptosis morphology with different amplification ratio

從圖1中可以看出:藥物與HeLa細胞作用后,HeLa細胞形態(tài)發(fā)生變化,細胞核收縮并發(fā)生形變.表明以鎂化合物載入的順鉑藥物對HeLa細胞發(fā)生了抑制作用,產(chǎn)生了凋亡現(xiàn)象

流式細胞儀根據(jù)凋亡細胞DNA含量變化和細胞膜磷脂分布變動,采用熒光染色劑標記檢測凋亡情況,結(jié)果如圖2所示.

圖2 藥物與HeLa細胞作用12 h的流式凋亡圖Fig.2 Flow cytometric analysis of drug and HeLa cells for 12 h

圖中右下象限為早期凋亡,右上象限為晚期凋亡,左上象限為機械損傷細胞,左下象限為活細胞.分析(a),(b)兩組象限細胞計數(shù),碳酸鎂負載順鉑對HeLa細胞的早期凋亡率(90.9 %)優(yōu)于氫氧化鎂(68.6 %),而氫氧化鎂負載順鉑對HeLa細胞的晚期凋亡率(29.1 %)比碳酸鎂(8.4 %)的更佳,12 h后,存活的HeLa細胞數(shù)不足3 %(0.7 %,2.2 %),由此說明兩種鎂化合物作為藥物載體,成功負載了順鉑藥物,使藥物對HeLa細胞有較強的殺傷活性,產(chǎn)生了明顯的細胞誘導凋亡現(xiàn)象.

2.2 藥物的半數(shù)抑制濃度結(jié)果

藥物對腫瘤細胞的體外活性實驗通過MTT法實現(xiàn),由半數(shù)抑制濃度IC50值評價.所有實驗都在相同條件下重復3次并取平均值.單純順鉑、碳酸鎂負載順鉑和氫氧化鎂負載順鉑得到的對HeLa細胞的IC50值分別為4.215±0.205、4.101±0.145和4.113±0.235.數(shù)據(jù)表明,順鉑對HeLa細胞有明顯的抑制效果,兩種鎂藥物載體載入順鉑藥物后,同樣對細胞有較強的抑制能力,其抑制活性分別提高了2.7 %,2.4 %.

綜上實驗結(jié)果表明,以臨床順鉑對HeLa細胞的研究為對象,順鉑是已知抗腫瘤藥物中的首選抑制劑.食藥級的碳酸鎂和氫氧化鎂是順鉑藥物的優(yōu)良載體,由于粒徑均勻和豐富的比表面積等特點,以分子間弱作用力對順鉑藥物進行負載.在負載體系的組分進入HeLa細胞組織中,順鉑優(yōu)先水解成順式二胺二水中間產(chǎn)物,與腫瘤細胞中DNA靶向分子鳥嘌呤N7共價結(jié)合[15-16],阻礙了DNA復制,從而發(fā)揮了抑制腫瘤細胞的增長.而鎂負載體將順鉑藥物輸送到腫瘤組織細胞后,少量與順鉑交聯(lián)的鎂化合物可能主要以靜電方式與腫瘤細胞發(fā)生微弱作用,并適當增加順鉑對腫瘤細胞的抑制效果,而鎂化合物主體部分在完成載藥、送藥和釋藥功能后,會與順鉑復合物自動拆分,游離在細胞組織液外.

2.3 熒光猝滅機理

溴化乙錠(EtBr)為扁平分子探針,可與DNA堿基對發(fā)生嵌插作用,從而使DNA-EtBr復合物熒光發(fā)射峰大為增強,被視為熒光生物分子探針[17].圖3為載藥后順鉑藥物對DNA-EtBr復合物熒光猝滅趨勢圖譜.由圖3可以看出:載藥后的順鉑對DNA-EtBr的熒光有顯著的熒光猝滅能力,表明順鉑藥物與EtBr競爭,嵌入到DNA堿基對中,發(fā)生Pt—N7共價鍵合和嵌入作用兩種協(xié)同作用模式,將EtBr從DNA分子中擠出,造成DNA-EtBr熒光值下降.實驗條件下,在波長612 nm,617 nm處,碳酸鎂負載順鉑和氫氧化鎂負載順鉑對DNA-EtBr的猝滅率分別為25.72 %和27.69 %,即負載藥物與靶向DNA發(fā)生了較強的作用.

c(DNA)=5×10-6mol·L-1c(EtBr)1×10-6mol·L-11c(藥物)=0 mol·L-12c(藥物)=0.5×10-6mol·L-13c(藥物)=1.0×10-6mol·L-14c(藥物)=1.5×10-6mol·L-15c(藥物)=2.0×10-6mol·L-16c(藥物)=2.5×10-6mol·L-1

圖3 藥物與DNA作用的熒光圖
Fig.3 Fluorescence of drug and DNA

3 結(jié) 論

通過化學合成和表征,碳酸鎂和氫氧化鎂達到了食藥級標準.兩種鎂化合物對臨床順鉑藥物具有載藥功能,并能將藥物分子輸送到腫瘤細胞組織中,對HeLa細胞有較強的細胞凋亡功能和細胞抑制活性.載藥后的順鉑與單獨順鉑對 HeLa細胞具有同樣或略有提高的抑制效果,與IC50結(jié)果相佐證.熒光猝滅結(jié)果證實了載藥后的順鉑藥物與靶向DNA分子之間發(fā)生了Pt—N(7)共價鍵合和嵌入作用兩種協(xié)同作用模式.