岑凱瑩 王海穎

（上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 200120）

肺炎支原體肺炎（MPP）是由肺炎支原體（MP）引起的，病理改變多以間質(zhì)性肺炎為主，并且可導(dǎo)致血液、神經(jīng)、消化、泌尿、循環(huán)等多系統(tǒng)及皮膚的病變[1]。目前認(rèn)為主要機(jī)制是機(jī)體對(duì)肺炎支原體感染產(chǎn)生過(guò)度的免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞因子的生產(chǎn)過(guò)剩和免疫細(xì)胞的激活[2-3]。白細(xì)胞介素-6（IL-6）、干擾素-γ（IFN-γ）作為免疫與炎癥重要的調(diào)節(jié)因子引起過(guò)度的免疫炎癥反應(yīng)，參與 MPP 的發(fā)病過(guò)程[4]。小復(fù)方（組成：魚(yú)腥草 15 g，地龍9 g，桑白皮9 g）是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院姜擁紅教授治療小兒支原體肺炎常用方，具有良好的臨床療效，本課題組前期藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此3味藥醇提物及水提物都具有抑制支原體體外生長(zhǎng)的作用，且地龍組、魚(yú)腥草地龍合用組、復(fù)方組體外抑菌作用最強(qiáng)，然而其不同配伍方式以及不同提取物對(duì)抗MP感染的作用差異尚不明確，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究地龍單味中藥、地龍魚(yú)腥草配伍，3藥聯(lián)用對(duì)MP感染小鼠血清中IFN-γ、IL-6的表達(dá)影響，及對(duì)肺組織病理變化的影響，探討其MP可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)4周齡BALB/c小鼠 （批號(hào)：0307646）80只，雌雄各半，體質(zhì)量 17～20 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試藥與儀器 1）試藥。MP標(biāo)準(zhǔn)菌株 （ATCC-15531，美國(guó)ATCC公司）。魚(yú)腥草、地龍、桑白皮飲片（批號(hào)：160625，160711，160308，上?？禈蛑兴庯嬈荆?，阿奇霉素片（國(guó)藥準(zhǔn)字H10960167，希舒美），支原體肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基、支原體添加劑（批號(hào)：CM0403B，SR0059C英國(guó)OXOID），MP核酸檢測(cè)試劑 （#DA-D064達(dá)安基因），小鼠白介素-6（IL-6）檢測(cè)試劑盒、小鼠干擾素-γ（IFN-γ）檢測(cè)試劑盒（批號(hào) xy-E11921，xyA049Mu，上海信裕生物科技有限公司），其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口的分析純?cè)噭?）實(shí)驗(yàn)儀器。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA上海亞榮生化儀器廠），ASC電子稱（ASC-6上海東南衡器有限公司），電子調(diào)溫電熱套（98-I-B天津市泰斯特儀器有限公司），生物安全柜（BSC-1000IIA2蘇凈集團(tuán)），低溫離心機(jī) （2-16PK Sigma公司），酶標(biāo)儀（Synergy HT BIOTEK），石蠟切片機(jī)（SQ2125 徠克公司），攤片機(jī)（PPTHK-21B 徠克公司），正置顯微鏡（CX41OLYMPUS）。

1.3 中藥提取物制備及MP培養(yǎng) 1）藥物制備。取單味藥、魚(yú)腥草∶地龍（5∶3）、魚(yú)腥草∶地龍∶桑白皮（5∶3∶3）混合，用打粉機(jī)粉碎，采用水煎法進(jìn)行中藥水提，所得藥液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低溫濃縮，然后干燥脫水，即得中藥水提物。藥液過(guò)濾后藥渣加70%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并濾液后用紗布過(guò)濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮回收乙醇，所得濃縮液干燥脫水，即得中藥醇提物。2）MP培養(yǎng)。將MP接種在支原體肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)5～6 d，至培養(yǎng)基著色變黃并呈均勻一致的混濁時(shí)，收獲處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人MP菌液，收獲的菌液取少量傳代觀察，CCU法定量，調(diào)整菌液濃度至1×107ccu/mL，-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 造模與分組 選取80只BALB/C小鼠隨機(jī)分為造模組72只，正常組8只。造模組小鼠經(jīng)乙醚麻醉后，鼻內(nèi)接種 30 μL 1×107ccu/L MP 菌液，每天 1 次，共3 d，建立MP感染模型，正常組小鼠給予等量PBS。觀察小鼠體征表現(xiàn)，造模3 d后，隨機(jī)挑選8只造模組小鼠，摘眼球取血，2500 r/min，4℃離心 10 min，吸取上清，參照MP核酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作進(jìn)行支原體檢測(cè)，結(jié)果顯陽(yáng)性，則表明造模成功。MP感染模型成功后，將造模組小鼠隨機(jī)分為模型組、阿奇霉素組、地龍水提組、地龍醇提組、魚(yú)腥草+地龍水提組、魚(yú)腥草+地龍醇提物組、小復(fù)方水提物組、小復(fù)方醇提物組，每組8只。

1.5 干預(yù)方法 各給藥組給予相應(yīng)提取物混懸液，依臨床給藥劑量換算為小鼠等效劑量，地龍水提組、地龍醇提物組為 1.5 g/（kg·d）；魚(yú)腥草地龍水提組、魚(yú)腥草地龍醇提組為4 g/（kg·d）；小復(fù)方水提組、小復(fù)方醇提組為 5.5 g/（kg·d），阿奇霉素組為 41.67 mg/（kg·d），給藥容積0.1 mL/10 g體質(zhì)量，連續(xù)給藥7 d。正常組和模型組小鼠給予等量生理鹽水，各組小鼠均正常喂養(yǎng)，自由飲水。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）小鼠每日稱體質(zhì)量、記錄精神狀態(tài)及體質(zhì)量變化。2）末次給藥后，摘眼球取血，4℃，2500 r/min離心10 min，取上層血清-80℃凍存?zhèn)溆?。取小鼠肺組織，左肺用4%多聚甲醛固定，用于HE染色，右肺液氮凍存，轉(zhuǎn)移-80℃冰箱中保存，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。2）肺濕質(zhì)量：稱取小鼠的肺組織，計(jì)算肺濕重指數(shù)[（肺質(zhì)量/體質(zhì)量）×100%]。 3）白介素-8（IL-8）和IFN-γ：取各組小鼠血清，參照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，檢測(cè)血清中IL-6和IFN-γ的含量。4）肺組織病理學(xué)觀察：取小鼠肺組織，置于10%甲醛中固定48 h，流水洗滌組織，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片，切片厚度為4～7 μm。65℃烤片、二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度乙醇水化，蘇木素-伊紅染色，二甲苯透明和封片，通過(guò)顯微鏡拍照，采集分析樣本相關(guān)部位。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)方法，等級(jí)資料非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常組小鼠狀況良好，活潑愛(ài)動(dòng)，反應(yīng)靈敏。模型組小鼠有寒戰(zhàn)，精神萎靡，食欲減退，體質(zhì)量下降等表現(xiàn)。各治療組小鼠相較于模型組癥狀有所減輕。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量、肺質(zhì)量、肺濕質(zhì)量指數(shù)比較見(jiàn)表1。與正常組相比，模型組小鼠體質(zhì)量及肺質(zhì)量顯著下降（P＜0.05），肺濕質(zhì)量指數(shù)顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，各給藥組體質(zhì)量顯著上升（P＜0.05），給藥7 d后，各給藥組小鼠肺濕質(zhì)量指數(shù)均有不同程度的下降，其中阿奇霉素組、魚(yú)腥草+地龍水提物組、魚(yú)腥草+地龍醇提物組、小復(fù)方水提物組、小復(fù)方醇提物組小鼠肺濕質(zhì)量指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

2.3 各組肺組織病理學(xué)觀察 見(jiàn)表2，圖1。從HE染色的結(jié)果可以看出，正常組肺泡結(jié)構(gòu)均勻清晰，肺泡內(nèi)無(wú)滲出，偶見(jiàn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)在支氣管和血管周圍及肺泡間隔；模型組MP感染小鼠肺組織出現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎以及融合性支氣管肺炎變化，肺泡腔狹窄、縮小。肺泡隔增厚，肺泡間質(zhì)中有大量炎性細(xì)胞增生和浸潤(rùn)；與模型組相比，各給藥組的間質(zhì)性炎癥反應(yīng)減輕，淋巴和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。其中阿奇霉素組、魚(yú)腥草+地龍醇提物組、小復(fù)方水提組、小復(fù)方醇提組，病理癥狀改善更為顯著。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、肺質(zhì)量、肺濕質(zhì)量指數(shù)比較（±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量、肺質(zhì)量、肺濕質(zhì)量指數(shù)比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

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圖1 各組小鼠肺組織病理改變（HE染色，200倍）

表2 各組MP感染小鼠肺組織病理變化（n）

2.4 各組小鼠血清IFN-γ、IL-6的表達(dá)水平比較 見(jiàn)表3。與正常組相比模型組小鼠血清中IFN-γ、IL-6的表達(dá)水平較高（P＜0.05），與模型組相比各給藥組小鼠血清中 IFN-γ、IL-6 的表達(dá)水平降低（P＜0.05）。

表3 各組小鼠血清IFN-γ、IL-6的表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組小鼠血清IFN-γ、IL-6的表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

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3 討 論

MP感染臨床多以上感、支氣管炎、肺炎等證為表現(xiàn)，證屬中醫(yī)“肺炎喘嗽”“肺風(fēng)咳嗽”范疇。外感六淫時(shí)邪、正氣虧虛為本病的兩大病因，臨床上治療本病多以清熱解毒、燥濕化痰及止咳平喘為主。小復(fù)方中魚(yú)腥草歸肺經(jīng)、膀胱、大腸經(jīng)，是“肺癰”要藥，具有清熱解毒，化痰消癰，利尿通淋的作用?，F(xiàn)代研究表明具有抗氧化、抑制細(xì)菌、抗病毒、抗炎癥、抗腫瘤和提高免疫力等功效[5]。地龍歸肝、肺、腎經(jīng)，具有清熱止痙，平喘利尿，通絡(luò)活血的功效，具有調(diào)節(jié)免疫抗菌消炎、止咳平喘等作用[6]。桑白皮入肺經(jīng)、脾經(jīng)，具有瀉肺平喘；利水消腫的功效，現(xiàn)代藥理學(xué)表明具有抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘和提高免疫力等功效[7]。魚(yú)腥草、地龍、桑白皮均為臨床治療肺系疾病常用的藥，3藥聯(lián)用清熱解毒、止咳平喘。前期研究發(fā)現(xiàn)地龍水提物、地龍醇提物、魚(yú)腥草+地龍水提物、魚(yú)腥草+地龍醇提物、小復(fù)方水提物及醇提物體外抑制MP作用較好，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合中醫(yī)理論，探索小復(fù)方提取物及不同配伍方式對(duì)MP感染小鼠的作用，并研究其可能的作用機(jī)制。

迄今為止，MPP發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，目前主要有呼吸道上皮細(xì)胞黏附、免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制和MP直接侵入學(xué)說(shuō)，國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)細(xì)胞因子在MP感染的發(fā)病中起著重要作用[8-9]。IL-6是炎癥急性期合成的重要介質(zhì)，并參與肺部炎癥的病理過(guò)程，在維持動(dòng)態(tài)平衡，在機(jī)體免疫自穩(wěn)、免疫防御中起著重要作用[10]。研究者發(fā)現(xiàn)MP感染小鼠肺泡灌洗液中IL-6水平與MP感染程度成正相關(guān)，血清中IL-6濃度可反映MPP患兒的病情輕重，IL-6在MPP的發(fā)病發(fā)展過(guò)程中起重要作用[11-12]。IFN-γ由活化T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）產(chǎn)生，IFN-γ具有抗病毒，激活體液免疫的作用[13]，研究表明IFN-γ水平變化有助于早期識(shí)別 RMPP[14-15]。

過(guò)度的免疫應(yīng)答，包括細(xì)胞因子的生產(chǎn)過(guò)剩和免疫細(xì)胞的激活，是MP的主要發(fā)病機(jī)制，因此及早抑制炎癥因子的表達(dá)，抑制過(guò)度免疫，是治療MP的有效途經(jīng)之一。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中IFN-γ、IL-6的表達(dá)水平較高，而各治療組小鼠血清中IFN-γ、IL-6的表達(dá)水平均有一定程度的降低，其中復(fù)方醇提物組，魚(yú)腥草+地龍醇提物組降低更為顯著。

病理組織學(xué)觀察小鼠肺臟的變化，發(fā)現(xiàn)模型組有大量淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)，各治療組病理癥狀均得到一定程度的改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各中藥提取物均可減輕MP感染小鼠炎癥程度，其中復(fù)方醇提物組優(yōu)于其他提取物組，其抗MP感染的作用機(jī)制可能與下調(diào)IFN-γ和IL-6表達(dá)水平，抑制過(guò)度免疫有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。