李玉蕾 ，顏 慧 ，王莉莉 ，宮澤輝 ，蘇瑞斌

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，2.抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，3.神經(jīng)精神藥理學(xué)北京市重點實驗室，北京 100850）

研究表明，δ阿片受體（delta opioid receptor，DOR）的激活可減輕慢性疼痛及負(fù)性情緒狀態(tài)（如抑郁），且DOR在神經(jīng)保護(hù)、藥物濫用和沖動控制障礙等方面的作用也有相關(guān)研究報道［1］，是新藥研發(fā)的重要靶標(biāo)。因此，建立高效篩選靶向DOR配體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的重要性不言而喻。

以往建立的DOR單基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株陽性克隆的篩選方法，無論是RT-PCR和Western蛋白印跡法，還是放射性配體受體結(jié)合實驗等，都存在細(xì)胞用量大、過程繁瑣和實驗周期長的缺陷，常會延遲陰性克隆的去除，且篩選出的陽性克隆還需再進(jìn)行功能分析，投入的資金與精力較多［2-3］。

高內(nèi)涵分析（high-contentanalysis，HCA）是通過對熒光標(biāo)記物的分析，檢測生物刺激或藥物處理導(dǎo)致多種細(xì)胞反應(yīng)的技術(shù)，目前已成為一個成熟的工具。通過HCA揭示的化合物對細(xì)胞的影響與化合物特異性有助于在藥物研發(fā)的早期得出明確的結(jié)論，有望大大提高藥物研發(fā)的效率［4-5］。

本研究利用HCA方法建立了人DOR（human DOR，hDOR）與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）標(biāo)記的蛋白激酶A催化亞基（catalytic domain of cAMP-dependent protein kinase A，PKAcat）融合蛋白（PKAcat-EGFP）穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞模型，并利用特異性DOR激動劑SNC80對其功能進(jìn)行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

穩(wěn)定表達(dá)PKAcat-EGFP的CHO細(xì)胞模型（CHO-PKAcat-EGFP）、pcDNA3.1/Hygro（+）質(zhì)粒、Bam H I、Eco R V限制性內(nèi)切酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、潮霉素B（hygromycin B，Hygro）、Lipofectam ine 2000、Hoechst33342 和 Hank′s平衡鹽溶液（Hank′s balanced saltsolution，HBSS）（美國Thermo Fisher Scientific公司）；pcDNA3.1（+）-hDOR質(zhì)粒（美國UMR cDNA資源中心）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京天根生物技術(shù)公司）；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（美國OMEGA公司）；F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；G418（美國Am resco公司）；SNC80、佛司可林（forskolin）和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）（美國 Sigma Aldrich 公司）；96孔黑色透底檢測板（美國Corning公司）；LANCE cAMP 384試劑盒和OptiPlate-384孔板（美國Perkin Elm er公司）；EVOSf1熒光倒置顯微鏡（美國AMG公司）；EnVision 2104多功能酶標(biāo)儀（美國Perkin Elmer公司）；In Cell Analyzer 1000高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)（美國GE Healthcare公司）。

1.2 p cDNA3.1/Hyg ro（+）-hDOR重組質(zhì)粒構(gòu)建

用Bam H I和Eco R V限制性內(nèi)切酶對pcDNA3.1（+）-hDOR質(zhì)粒和載體分別進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收hDOR與pcDNA3.1/Hygro（+）載體片段。將二者通過摩爾比（1∶1）連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α新鮮感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素的Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基平板篩選得到1～3號陽性菌落，分別接種于5m L含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。各克隆取部分菌液提取質(zhì)粒后，用Bam H I和Eco R V雙酶切消化后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時取部分菌液測序、比對，選擇序列比對結(jié)果正確的陽性克隆進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞

將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，第2天將pcDA3.1/Hygro（+）和pcDNA3.1/Hygro（+）-hDOR質(zhì)粒利用Lipofectam ine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。第3天傳代至75 cm2培養(yǎng)瓶中，第4天將含10%FBS的F12培養(yǎng)基更換成含Hygro 200 mg·L-1、G418 500 mg·L-1和10%FBS的F12培養(yǎng)基，每2 d換液1次。

1.4 有限稀釋法克隆化培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞

培養(yǎng)12 d后消化細(xì)胞，混勻后將細(xì)胞密度稀釋至5000 L-1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μL。6 d后鏡下觀察并標(biāo)記只含1個細(xì)胞克隆的孔，繼續(xù)培養(yǎng)至8 d后消化細(xì)胞克隆，取部分細(xì)胞接種至96孔黑色透底檢測板中，每個克隆3孔，準(zhǔn)備進(jìn)行鑒定。

1.5 PKA重分布實驗鑒定陽性克隆

每個克隆分為正常對照組、佛司可林組和SNC80組。細(xì)胞接種第2天，每孔加入100μL的F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，正常對照組和佛司可林組加入150μL F12培養(yǎng)基，SNC80組加入同體積含4 μm ol·L-1SNC80的F12培養(yǎng)基（SNC80終濃度1 μmol·L-1），細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 m in；孵育期間配制含40μmol·L-1佛司可林的F12培養(yǎng)基，各加50μL于佛司可林組和SNC80組（佛司可林終濃度10 μmol·L-1），正常對照組加50 μLF12培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5 m in；孵育結(jié)束后，每孔加入100μL 12%甲醛溶液固定20 m in，200μL PBS洗滌細(xì)胞3次，100 μLHochest33342 1 μmol·L-1染核。用In CellAnalyzer1000高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)獲取細(xì)胞熒光圖像，多靶點分析模塊（multitargetanalysis，MTA）分析PKAcat-EGFP的重分布程度，計算顆粒形成指數(shù)（fociformation index，F(xiàn)FI）。FFI=（顆粒熒光強(qiáng)度-背景熒光強(qiáng)度）×顆粒熒光總面積。實驗結(jié)果以SNC80抑制forskolin引起cAMP增高的活性表示?；钚裕?）=（SNC80組FFI-佛司可林組FFI）/（正常對照組FFI-佛司可林組FFI）×100%。

1.6 SNC80誘導(dǎo)陽性克隆PKAcat-EGFP重分布

CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞與篩選出的CHOPKAcat-EGFP/hDOR-3克隆細(xì)胞分別接種于96孔黑色透底檢測板，分為正常對照組、佛司可林組和SNC80組。實驗過程同1.5。EVOSf1熒光倒置顯微鏡觀察拍攝PKAcat-EGFP的重分布。

1.7 CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞模型可靠性評價

接種細(xì)胞于96孔黑色透底檢測板，分為正常對照組、佛司可林組和SNC80（100 nmol·L-1）組。實驗過程同1.5。用In Cell Analyzer 1000高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)獲取細(xì)胞熒光圖像，MTA分析PKAcat-EGFP的重分布程度，計算各組FFI與Z′因子。Z′=1-（3σC++3σC-）/︱μC+-μC-︱。其中，σ 為標(biāo)準(zhǔn)差；μ為平均值；C+為陽性對照（SNC80組）；C-為陰性對照（佛司可林組）。

1.8 LANCE cAMP 384試劑盒考察CHO-PKA-cat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞表達(dá)hDOR的穩(wěn)定性

細(xì)胞接種至60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。第2天，用凡爾生（Versene）溶液消化細(xì)胞，HBSS吹打并重懸細(xì)胞，1000×g離心5 m in，細(xì)胞沉淀加適量刺激緩沖液（HBSS 含 HEPES 5 mmol·L-1，0.1%BSA，IBMX 0.5mmol·L-1）重懸并計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1.2×109L-1。在Op tiPlate-384孔板中，分為正常對照組、佛司可林組和SNC80組。正常對照組每孔加入5μL刺激緩沖液，佛司可林組每孔加入2.5μL刺激緩沖液和2.5 μL 40 μmo l·L-1佛司可林（終濃度10 μmol·L-1），SNC80組每孔加入2.5 μL 4 μmol·L-1SNC80（終濃度 1 μmol·L-1）和 2.5 μL 40 μm ol·L-1佛司可林（終濃度10 μmol·L-1），各組每孔加入5 μL細(xì)胞-抗體復(fù)合物，混合后室溫孵育30 m in，每孔加入10μL檢測復(fù)合物，混合后室溫孵育1 h。EnVision 2104多功能酶標(biāo)儀測定665 nm發(fā)射波長的熒光強(qiáng)度。

1.9 用CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞模型評價藥物活性

細(xì)胞接種于96孔黑色透底檢測板，分為正常對照組、佛司可林組和不同濃度SNC80（0.01，0.02，0.05，0.14，0.41，1.23，3.70，11.11，33.33 和100.00 nmol·L-1）組，每組4復(fù)孔。實驗過程與計算公式同1.5。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Hyg ro（+）-hDOR的構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，1～3號陽性菌落在約1100 bp處均有目的條帶（圖1），證明hDOR基因片段已正確插入到重組質(zhì)粒中并特異表達(dá)。其中1號陽性菌落測序結(jié)果與PubMed中hDOR DNA序列（No.NM_000911.3）比對完全一致，表明重組質(zhì)粒已正確構(gòu)建，可用于后續(xù)實驗。

Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of pcDNA3.1/hygrom ycin B(Hygro)（+）-human delta opioid receptor（hDOR） recom binan t p lasm id digested with Bam H l and EcoR V.1-3：positive colony of pcDNA3.1/Hygro（+）-hDOR；M：DNAm arker.

2.2 篩選陽性克隆

克隆化培養(yǎng)挑選出53個單克隆，利用PKA重分布實驗經(jīng)過2次篩選，選出平均活性較高、細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化且生長狀態(tài)穩(wěn)定的3號克隆細(xì)胞株（CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3）進(jìn)行后續(xù)實驗（圖2）。

2.3 SNC80誘導(dǎo)CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞內(nèi)PKAcat-EGFP重分布

如圖3所示，在CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞和CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞中，單獨給予佛司可林組細(xì)胞中熒光顆粒較相應(yīng)正常對照組均顯著減少。在CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞中，預(yù)先給予SNC80 1μmol·L-1組細(xì)胞熒光顆粒較佛司可林組顯著增多，即PKAcat-EGFP發(fā)生了顯著的重分布現(xiàn)象；而在CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞中，由于該細(xì)胞無hDOR表達(dá)，故對SNC80無反應(yīng)，表現(xiàn)為SNC80組與佛司可林組細(xì)胞熒光顆粒無明顯改變。

2.4 CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞模型可靠性評價

Z′因子廣泛應(yīng)用于高通量篩選、HCA實驗體系的穩(wěn)定性和可靠性的評價之中，實驗過程、儀器、化合物及其濃度均可影響Z′因子值，1≥Z′≥0。Z′=0，說明該實驗體系不成立；0.5＞Z′＞0，說明該實驗體系穩(wěn)定性差；當(dāng)1＞Z′≥0.5，說明實驗體系穩(wěn)定性好；當(dāng) Z′=1 時，則表示一種理想的實驗體系［6］。SNC80 100 nmol·L-1作用時的Z′平均值為0.615（圖4），證明該細(xì)胞模型穩(wěn)定可靠。

2.5 CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞表達(dá)hDOR穩(wěn)定性評價

LANCE cAMP 384試劑盒是一種均相時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析。該測定基于銪（Eu）標(biāo)記的cAMP示蹤劑復(fù)合物與樣品cAMP競爭AlexaFluor 647標(biāo)記的cAMP特異性抗體上的結(jié)合位點。通過生物素-cAMP（b-cAMP）和銪-W 8044螯合物（Eu-SA）標(biāo)記的鏈霉親和素檢測銪標(biāo)記的cAMP示蹤劑復(fù)合物。當(dāng)抗體結(jié)合Eu-SA/b-cAMP示蹤劑時，340 nm激發(fā)光激發(fā)示蹤劑的Eu-SA分子，其發(fā)射的能量被轉(zhuǎn)移到抗體上的Alexa分子上，產(chǎn)生665 nm的發(fā)射光。測試樣品中cAMP的濃度與熒光強(qiáng)度成反比。如圖5所示，以CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞凍存后再復(fù)蘇的細(xì)胞作為第1代，經(jīng)反復(fù)傳代，用其第5代、第25代和第40代細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定性評價，單獨給予佛司可林10μmol·L-1組熒光強(qiáng)度較正常對照組明顯降低（P<0.01），而同時給予佛司可林10 μmol·L-1和SNC80 1μmol·L-1組與佛司可林組比較，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P<0.01）。表明細(xì)胞中的hDOR在40代以內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)，可滿足實驗需求。

Fig.2 CHO-PKAcat-EGFP/hDOR c lone sc reening by PKA red istribu tion assay.Cells were treated with SNC80 1 μmol·L-1 for 30m in and forskolin 10 μmol·L-1 for 5 m in.A：the primary screening；B：the second screening.PKAcat：catalytic domain of cAMP-dependentprotein kinase A；EGFP:enhanced green fluorescentprotein.

Fig.3 PKAcat-EGFP redistribution in CHO-PKAcat-EGFP and CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3 c lone.Cells in forskolin group were treated with forskolin 10 μmol·L-1 for5m in.Cells in forskolin+SNC80 group were treated with SNC80 1 μmol·L-1 for30min and forskolin 10 μmol·L-1 for5m in.

Fig.4 Values of Z′facto r for evaluation and validation reliability of the CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3 c lone cell m odelby PKA red istribu tion assay.Cells were treated with SNC80 100 nmol·L-1 for 30m in.x±s，n=8.

Fig.5 Effects of forsko lin and SNC80 on cAMP concentration in CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3 c lone by LANCE cAMP 384 kit.Cells in forskolin group were treated with forskolin 10 μm ol·L-1 for 30 m in.Ce lls in forsko lin+SNC80 group were treated with SNC80 1 μmol·L-1 and forskolin 10 μmol·L-1 for 30m in.A-C：cell passage num ber 5，25 and 40.x±s，n=3.＊＊P<0.01，com pared with norm a l contro l group；##P<0.01，compared with forsko lin group.

2.6 用CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞模型評價藥物活性

在PKA重分布實驗中，陽性藥SNC80（1×10-7～1×10-11mol·L-1）可濃度依賴性地激活CHO-PKA-cat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞上的hDOR（圖6），其EC50值為（6.192±1.225）×10-9mol·L-1，與文獻(xiàn)報道基本一致［7］。

Fig.6 Concen tration-response cu rves of SNC80 in CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3 cells by PKA redistribution assay.Cells were treated with SNC80 0.01，0.02，0.05，0.14，0.41，1.23，3.70，11.11，33.33 and 100.00 nm ol·L-1 for 30 m in and forskolin 10 μm ol·L-1 for 5 m in.x±s，n=3.

3 討論

將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞中的轉(zhuǎn)染技術(shù)，已成為考察表達(dá)蛋白功能的常規(guī)生物學(xué)手段。其中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染與瞬時轉(zhuǎn)染相比，具有在不同批次實驗中基因表達(dá)水平差異小和表達(dá)持續(xù)時間長等優(yōu)點。本研究利用HCA方法建立的hDOR與PKAcat-EGFP共表達(dá)細(xì)胞與DOR單轉(zhuǎn)細(xì)胞相比，還存在細(xì)胞用量少、實驗周期短及在96孔板水平即可篩選出陽性克隆等多種優(yōu)勢。與hDOR相關(guān)其他藥物篩選模型相比，如放射性配體受體結(jié)合實驗，僅能考察藥物與受體的親和力；［35S］GTPγS結(jié)合實驗，僅能考察藥物對受體后G蛋白的激活能力；而本細(xì)胞模型可通過檢測hDOR信號通路較下游的信號分子PKA重分布考察藥物對受體功能的影響，其過程快速，結(jié)果直觀，非常適合靶向DOR配體的高通量快速篩選。

PKA作為cAMP依賴性蛋白激酶，其活化受胞內(nèi)cAMP濃度的影響。未做處理的細(xì)胞中，cAMP濃度較低，PKAcat-EGFP在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)高亮度熒光顆粒聚集體；當(dāng)cAMP濃度升高時，PKAcat-EGFP會從聚集體中釋放出來，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)熒光顆粒的減少。由于DOR為Gi蛋白偶聯(lián)受體，激活后抑制AC，阻礙ATP形成cAMP，導(dǎo)致PKAcat-EGFP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成顆粒，與未處理細(xì)胞表現(xiàn)一致，因此需加入AC激動劑佛司可林［8］，升高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，使PKAcat-EGFP在細(xì)胞質(zhì)中呈彌散分布。利用PKA的這種重分布現(xiàn)象即可檢測化合物對受體功能的影響［9-10］。

本研究建立CHO-PKAcat-EGFP/hDOR-3細(xì)胞模型，通過PKA重分布實驗與LANCE cAMP 384試劑盒2種實驗均證明其表達(dá)的hDOR具有活性，且hDOR在40代以內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)，表明該細(xì)胞模型構(gòu)建成功，為考察hDOR的功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，開展高通量篩選，研發(fā)出更好、更有效的hDOR激動劑類藥物建立了很好的平臺，同時也為進(jìn)一步研究DOR激動劑的藥理作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。