談 勇，許夢川，王 遠(yuǎn)，張 芳，李小滿，陳 豪，趙寶全，汪雪雁

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，北京 100850；3.解放軍總醫(yī)院腎臟疾病國家重點(diǎn)實驗室，北京 100853）

鋁是地殼中除氧、硅之外最多的元素，也是最豐富的金屬元素，鋁在人們的日常生活中得到廣泛使用，尤其在食品、飲用水和藥品等方面［1］。然而，鋁離子一旦進(jìn)入人體，可在大腦內(nèi)沉積，造成嚴(yán)重的記憶力喪失。已發(fā)現(xiàn)鋁具有毒性，在體內(nèi)蓄積后會引發(fā)一系列疾病，如抑制軟骨細(xì)胞活性和軟骨膠原的合成，增強(qiáng)軟骨基質(zhì)降解，導(dǎo)致軟骨損傷；引起尿鈣排泄量增加，導(dǎo)致人體內(nèi)鈣量不足等，進(jìn)而導(dǎo)致一系列疾病，尤其是神經(jīng)毒性疾?。?-3］。然而現(xiàn)在很多市售食品鋁含量超標(biāo)［4］，長期食用后會對身體健康造成不可逆的傷害，需要引起高度重視。鋁超標(biāo)造成兒童的神經(jīng)毒害研究鮮有報道，相關(guān)動物模型非常有限。近年來，斑馬魚作為神經(jīng)毒性研究的模型動物發(fā)展迅速，與其他模型動物相比斑馬魚具有獨(dú)特優(yōu)勢：①常年產(chǎn)卵、體型小、發(fā)育快、易于飼養(yǎng)、體外受精，早期胚胎透明，易于觀察［5］；②與人類的基因具有很高同源性［6］；③在神經(jīng)生理、解剖以及基因結(jié)構(gòu)功能上，與髙等動物具有高度相似性［7］。因此，本研究以斑馬魚幼魚為模型探討鋁對其運(yùn)動行為的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

無水氯化鋁（AlCl3）、無水氯化鎂、蔗糖和二甲亞砜（DMSO）中國國藥集團(tuán)；二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）上海碧云天生物技術(shù)有限公司；通用型組織固定液，武漢谷歌生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒和SYBR Prem ix Ex Taq，天根生化科技（北京）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Prom ega公司；引物合成由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司完成。斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，北京愛生科技公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；X221942H型光學(xué)顯微鏡，日本尼康公司；多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司；LightCycler?96實時熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；DVOC-0040 Daniovision行為學(xué)系統(tǒng)，荷蘭Noldus公司。

1.2 實驗動物

AB系成年斑馬魚由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，本實驗室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)，循環(huán)養(yǎng)殖水按照Brand等［8］的方法配制：毎1000 L去離子水中含NaHCO375 g，海鹽 18 g和 CaSO48.4 g，水溫28～29℃，pH值約7.2，總硬度62m g·L-1（以CaCO3計），電導(dǎo)率485 μS，光照/黑暗周期為14 h/10 h。斑馬魚胚胎由E3培養(yǎng)液培養(yǎng)，E3培養(yǎng)液亦按照上述Brand等［8］方法配制：每1000 L去離子水中含NaCl292.5 g，KCl12.67 g，CaCl236.63 g和，MgSO439.6 g，并用NaHCO3溶液調(diào)pH值至7.2，電導(dǎo)率600μS，斑馬魚胚胎置于生化恒溫培養(yǎng)箱中，溫度控制在28～29℃，光照/黑暗周期為14 h/10 h。

1.3 斑馬魚幼魚AlCl3暴露實驗

AlCl3水中易發(fā)生水解，用 0.1mmol·L-1稀鹽酸溶解，加水配制成1 g·L-1的母液備用，實驗前用E3培養(yǎng)液稀釋成 50，100和150 μg·L-1，調(diào) pH 至5.8［9-10］。選取受精3 d且表型正常的斑馬魚幼魚，隨機(jī)分為AlCl30（正常對照），50，100和150 μg·L-1組，分別用100 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，每皿放入50條幼魚和含不同濃度AlCl3的E3培養(yǎng)液10m L，置生化恒溫培養(yǎng)箱中分別暴露48，72和96 h。實驗重復(fù)3次。

1.4 斑馬魚幼魚運(yùn)動行為測定

AlCl3暴露后，每組隨機(jī)選取8條斑馬魚幼魚置于96孔平板中，每孔1條。將96孔平板放入Noldus視頻采集系統(tǒng)觀測平臺，采用Ethovision XT10.0軟件追蹤采集3m in內(nèi)斑馬魚幼魚的自發(fā)運(yùn)動路線圖，并計算各組總移動距離和平均運(yùn)動速度。實驗重復(fù)3次。

1.5 HE染色檢測斑馬魚幼魚眼組織病理變化

AlCl3暴露48，72和96 h后，隨機(jī)選取正常對照和AlCl3150μg·L-1暴露組的斑馬魚幼魚各6條，置4%多聚甲醛溶液中固定，制成石蠟切片（5μm），HE染色，顯微鏡觀察眼組織病理變化。

1.6 斑馬魚幼魚體內(nèi)活性氧（reac tive oxygen species，ROS）的檢測［11］

每組取10條幼魚放入1.5 m L離心管中，用預(yù)冷的PBS（pH值7.4）洗滌2次，然后在預(yù)冷的緩沖液（蔗糖 0.32 mmol·L-1，HEPES 20 mmol·L-1，MgCl21 mmol·L-1和苯甲基磺酰氟 0.5 mmol·L-1，pH值7.4）中研磨均勻。15 000×g，4℃下離心20 m in，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中待用。分別取20μL上清液于96孔板中，室溫下放置5 m in，接著每孔加入100 μL PBS（pH 7.4）和8.3 μLDCFHDA原液（DMSO溶解，10 g·L-1），37℃溫育30 m in。最后，用多功能酶標(biāo)儀（激發(fā)光485 nm，發(fā)射光530 nm）測定熒光強(qiáng)度，以反映ROS濃度（單位：kDCF·g-1蛋白質(zhì)）。實驗重復(fù)3次。

1.7 熒光定量PCR測定斑馬魚血腦屏障及神經(jīng)相關(guān)基因m RNA水平

每組各取30條斑馬魚幼魚置于1.5m L離心管中，按總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明書進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)體系20μL：SYBR Mix 10 μL，無 RNA 酶水 6.8 μL，上 下 游 引 物（表1）各0.6 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件為：94℃，5m in；94℃，30 s；60℃，30 s；40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，用LightCycler?96 Application Software軟件對實時熒光定量PCR反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行分析。以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)水平。

Tab.1 Prim er sequence for quan titative reverse transcrip tion-po lym erase chain reac tion（qPCR）

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 A lCl3對斑馬魚幼魚運(yùn)動行為的影響

AlCl3暴露48 h時，各組斑馬魚幼魚的運(yùn)動情況相似；而暴露72和96 h時，與正常對照組相比，AlCl3暴露組斑馬魚幼魚運(yùn)動情況有所不同，部分個體存在運(yùn)動軌跡雜亂，甚至停滯不動。如圖1所示，與正常對照組相比較，AlCl3暴露48 h，AlCl3暴露組的斑馬魚幼魚都出現(xiàn)了移動距離變短和移動速度降低的情況。其中，在AlCl350和100μg·L-1組斑馬魚幼魚移動距離和移動速度無統(tǒng)計學(xué)意義，AlCl3150μg·L-1組具有極顯著差異（P<0.01）。而在AlCl3暴露72和96 h，各濃度組斑馬魚幼魚的游動距離和速度相比正常對照組都出現(xiàn)明顯下降（P<0.01）。提示長期高濃度AlCl3的暴露可導(dǎo)致斑馬魚幼魚運(yùn)動障礙。

Fig.1 Effect of AlCl3 on m ovement d istance（A）and speed（B）of zeb rafish larvae.The locom otor activity of zebrafish larvae was recorded by Noldus Tracking System for 3 min.x±s，n=24.＊＊P<0.01，compared with normalcontrolgroup.

2.2 A lCl3對斑馬魚幼魚眼組織病理結(jié)構(gòu)的影響

病理結(jié)果顯示，與正常對照組相比，AlCl3暴露組斑馬魚幼魚眼晶狀體、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、內(nèi)網(wǎng)層、內(nèi)核層和視網(wǎng)膜色素層各部分的結(jié)構(gòu)均保持完整，未出現(xiàn)明顯的組織病理損傷（圖2）。提示AlCl3暴露對斑馬魚幼魚的視覺可能無明顯影響。

2.3 A lCl3對斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS水平的影響

Fig.2 Effect of A lCl3 on histopatho logical changes in zebrafish larvae eyes by HE staining.Rpe：retinal pigment epithelium layer；inl：inner nuclear layer；ipl：inner plexiform layer；gcl：ganglion cell layer.

與正常對照組比較，AlCl3暴露48 h，100和150μg·L-1組斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS顯著升高（P<0.05，P<0.01）；暴露72 和96 h，各濃度組的ROS水平均顯著增加（P<0.01）（圖3）。

Fig.3 Effect of AlCl3 on levelof reactive oxygen species（ROS）in zeb rafish larvae.，n=10.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with norm alcontrolgroup.

2.4 A lCl3對血腦屏障及神經(jīng)相關(guān)基因m RNA表達(dá)的影響

Fig.4 Effect of AlCl3 on m RNA expression of genes related to b lood-brain barrier and nervous system in zebrafish larvae by quantitative po lym erase chain reaction(qPCR).，n=30.＊P<0.05，＊＊P<0.01，com pared with norm a lcontro lgroup.

如圖4A所示，與正常對照組相比，AlCl3暴露48 h，50 μg·L-1組淀粉樣前體蛋白b（amyloid precursor protein b，appb）m RNA表達(dá)明顯升高（P<0.01），密封蛋白5a（claudin 5a，cldn5a）、早老素1（presenilin 1，psen1）、生長相關(guān)蛋白43（grow th-associated protein 43，gap43）和膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap）m RNA表達(dá)變化不明顯；100μg·L-1組psen1和gfap mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01，P<0.05）；150 μg·L-1組psen1，gap43和gfap m RNA水平明顯降低（P<0.01），cldn5a和appb表達(dá)無顯著變化。AlCl3暴露72 h，50 μg·L-1組gap43和gfap m RNA表達(dá)明顯降低（P<0.01），而cldn5a，appb和psen1m RNA表達(dá)變化不明顯；100和150 μg·L-1組appb和psen1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01），gap43和 gfap m RNA表達(dá)明顯降低（P<0.01），而cldn5a表達(dá)無顯著變化。AlCl3暴露96 h，50 μg·L-1組appb和gap43 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）；100 μg·L-1組appb和psen1 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01），gap43和gfap m RNA表達(dá)明顯降低（P<0.01，P<0.05），cldn5a表達(dá)下調(diào)不顯著；150 μg·L-1組appb和psen1 m RNA表達(dá)顯著升高（P<0.01），cldn5a，gap43和gfap m RNA表達(dá)明顯降低（P<0.01，P<0.05）。提示長期高濃度AlCl3暴露可導(dǎo)致斑馬魚appb和psen1表達(dá)上調(diào)以及cldn5a，gap43和gfap表達(dá)下調(diào)。

3 討論

鋁是人類生活中不可或缺的物質(zhì)，但大量的鋁進(jìn)入人體會對機(jī)體產(chǎn)生毒害作用。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品中鋁含量不要超過100 mg·kg-1，但現(xiàn)實生活中食品鋁含量超標(biāo)現(xiàn)象普遍存在。此外，鋁相關(guān)產(chǎn)業(yè)及環(huán)境周邊區(qū)域鋁含量往往較高，經(jīng)檢測從事鋁職業(yè)工作人員血鋁濃度高達(dá)50μg·L-1以上，且認(rèn)知功能出現(xiàn)變化［12］。鋁對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒害作用已得到證實，但對發(fā)育期兒童的神經(jīng)毒性如何卻鮮有報道。本文利用酸性AlCl3暴露處理斑馬魚幼魚研究鋁對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用。

行為學(xué)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鋁暴露后斑馬魚幼魚運(yùn)動速度變慢、運(yùn)動距離變短，表明鋁對斑馬魚幼魚運(yùn)動行為產(chǎn)生了影響，這與神經(jīng)疾病的一些行為表現(xiàn)極為相似［13］。病理觀察結(jié)果顯示，鋁暴露對斑馬魚幼魚眼球組織結(jié)構(gòu)無明顯損傷，提示鋁暴露產(chǎn)生的行為變化可能與視覺并無直接關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)，AlCl3暴露組斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS水平明顯升高，而ROS的增加往往會引起線粒體功能的喪失、金屬離子動態(tài)平衡的改變以及降低抗氧化防御，直接影響神經(jīng)元的突觸活動和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知及運(yùn)動功能障礙［14］，表明ROS過量產(chǎn)生可能是導(dǎo)致斑馬魚幼魚行為異常的原因之一。此外，已有文獻(xiàn)報道，鋁能滲透血腦屏障進(jìn)入大腦［15］，在整個腦內(nèi)積累，特別是海馬區(qū)［16］；可能導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡［17］、Aβ異常沉積［18］和神經(jīng)炎癥［19］，最終造成學(xué)習(xí)記憶及運(yùn)動行為的改變。但對于鋁通過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)的機(jī)制尚不清楚，因此本研究從構(gòu)成血腦屏障主要的緊密連接相關(guān)蛋白密封蛋白（claudin）的基因表達(dá)入手，發(fā)現(xiàn)cldn5a mRNA水平在低濃度AlCl3暴露時變化并不明顯，但在高濃度長時間作用下明顯降低。而緊密連接相關(guān)蛋白家族表達(dá)下調(diào)，會引發(fā)緊密連接結(jié)構(gòu)疏松，基膜結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)皮細(xì)胞皺縮，使血腦屏障作用減弱［20］，使鋁離子入腦。另外，本研究從Aβ蛋白和神經(jīng)發(fā)育方面研究發(fā)現(xiàn)，長期高濃度AlCl3暴露的斑馬魚幼魚appb和psen1 m RNA水平明顯上調(diào)，gap43和gfap m RNA水平明顯下調(diào)。psen1可調(diào)控γ分泌酶的合成，引起Aβ沉積，而Aβ具有較廣泛的細(xì)胞毒性，是阿爾茨海默病致病的主要因素之一［21-22］；gap43主要表達(dá)在再生軸突生長圓錐部位，對神經(jīng)纖維生長、發(fā)育、再生及突觸功能維持和遞質(zhì)釋放都起重要作用［23］；gfap是星形膠質(zhì)細(xì)胞的骨架中間絲蛋白和專門的中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)蛋白，其基因表達(dá)下調(diào)反映星形膠質(zhì)細(xì)胞處于非活化和非分裂狀態(tài)，表明神經(jīng)細(xì)胞再生與神經(jīng)組織修復(fù)可能處于抑制狀態(tài)［24］。

綜上，本研究結(jié)果證實，AlCl3暴露可抑制斑馬魚幼魚的運(yùn)動行為，其機(jī)制可能與促進(jìn)體內(nèi)ROS水平升高，影響血腦屏障及神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)，為研究鋁致神經(jīng)毒性作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。