石笑晴，吳虹林，何璽玉，

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍307醫(yī)院臨床學(xué)院，安徽合肥 230032；2.解放軍第307醫(yī)院兒科，北京 100071）

金屬汞（Hg）是自然界中唯一在常溫下呈液態(tài)的重金屬，具有密度大、流動性強(qiáng)和易揮發(fā)的特性，在生產(chǎn)和生活中應(yīng)用廣泛，同時對人體可造成不同程度的損害。汞中毒常見的途徑有呼吸道吸入、皮膚接觸和消化道吸收，亦可經(jīng)皮下、靜脈和肌內(nèi)注射吸收。短期、大量或長期Hg暴露后可對呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生不同程度損害，具體損害程度與Hg暴露途徑和劑量相關(guān)［1］。

體內(nèi)注射Hg多以自殺或故意傷害為目的，也可由迷信所致。皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)注射Hg后，多在局部發(fā)生毒性炎癥反應(yīng)，也可累及其他臟器引起全身中毒癥狀，大劑量靜脈注射Hg則可能發(fā)生肺栓塞及心、腦、肝或腎的嚴(yán)重?fù)p害而導(dǎo)致死亡［2-9］。近年來，國內(nèi)外Hg經(jīng)皮下、肌內(nèi)和靜脈注射進(jìn)入兒童體內(nèi)致汞中毒的案例報(bào)道逐漸增多［10-14］，國內(nèi)也有大劑量注射Hg致兒童汞中毒的報(bào)道［15］，但對于兒童外源性Hg暴露后的毒性作用研究較少。由于兒童處于生長發(fā)育階段，汞中毒后局部及全身的毒理作用機(jī)制尚不明了，而且現(xiàn)今兒童Hg中毒后的干預(yù)方式也多仿照成人的經(jīng)驗(yàn)采用螯合劑及手術(shù)治療。臨床治療干預(yù)過程中發(fā)現(xiàn)，過早進(jìn)行外科手術(shù)可能會導(dǎo)致Hg再次擴(kuò)散和吸收入血，使中毒加重，并需要多次手術(shù)治療。因此，需改進(jìn)選擇手術(shù)治療的方式及時機(jī)。本研究以幼齡新西蘭兔為研究對象，建立im給予汞中毒幼兔模型，探討注射Hg后的中毒表現(xiàn)、對神經(jīng)系統(tǒng)的影響、局部病理包裹形成的時間及在包裹形成前后血汞和尿汞水平的變化，為探討手術(shù)取Hg和螯合劑驅(qū)Hg聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)借鑒，同時也為兒童汞中毒神經(jīng)系統(tǒng)損傷評價(jià)和隨訪提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Hg（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，每瓶250 g），神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）試劑盒和星形膠質(zhì)源性蛋白（S100B）試劑盒（武漢云克隆動物有限公司），2%戊巴比妥鈉（北京普博斯生物科技有限公司），4%多聚甲醛（西隴化工股份有限公司）。X線透視機(jī)（普朗PLD5100B，南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司），光學(xué)顯微鏡（ECLIPSE E200，日本株式會社尼康），全自動酶標(biāo)儀（MK3，美國Thermo公司），電子分析天平（ME235S，德國Sartorius公司），低溫離心機(jī)（3K-15，美國Sigma公司），Agilent ICP-MS（7700x，美國Agilent公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和分組

雄性40日齡新西蘭兔20只，體質(zhì)量1000～1300 g〔北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（京）2015-0005〕，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)期間自由攝食（收取尿樣時禁食）、飲水。將幼兔隨機(jī)分為4組（n=5），分別為正常對照（0.9%生理鹽水0.1 m L·kg-1）及Hg 700，1400和2800 mg·kg-1組。

染毒方法仿照臨床病例的暴露途徑，臀部一次性im Hg染毒。查閱國內(nèi)外關(guān)于注射Hg的文獻(xiàn)及解放軍307醫(yī)院兒科所接診的注射Hg中毒的病例，篩選出有注射Hg劑量、有局部病理反應(yīng)和全身中毒癥狀的5例病例資料，除以相應(yīng)體質(zhì)量（按實(shí)測體質(zhì)量或不同年齡段體質(zhì)量換算公式計(jì)算）后所得數(shù)據(jù)分別為32，604，1360，1440和1600mg·kg-1，取中位數(shù)為中劑量組，約為1400 mg·kg-1，按毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中劑量倍數(shù)關(guān)系將700 mg·kg-1設(shè)為低劑量組，2800 mg·kg-1設(shè)為高劑量組。

1.3 一般狀況和體質(zhì)量變化

每日1次臨床觀察，記錄外觀體征（包括進(jìn)食狀態(tài)、毛發(fā)色澤、雙耳皮溫和顏色、精神狀態(tài)和尿便性狀）、注射部位變化（包括有無紅腫、結(jié)節(jié)、潰瘍或膿腫形成）和汞中毒反應(yīng)（包括有無分泌物增多、步態(tài)不穩(wěn)、行動障礙、痙攣或易激惹）。分別在染毒當(dāng)天（染毒后第0天）和染毒后7，14，21，28和35 d測體質(zhì)量。

1.4 注射局部X線檢查

分別在染毒前及染毒后0，7，14，21，28和35 d拍攝局部注射部位X線片，觀察Hg在局部的擴(kuò)散。將所有幼兔取至X線攝片室，ip給予2%戊巴比妥鈉40 m g·kg-1（2 m L·kg-1），先給前2/3藥量，觀察麻醉效果；麻醉后將其固定，保持側(cè)臥位，拍攝局部注射部位X線片。待X線片提示Hg的形態(tài)無明顯變化時，終止實(shí)驗(yàn)。

1.5 電感耦合等離子體質(zhì)譜法檢測血汞和尿汞水平

分別于染毒前及染毒后0，7，14，21，28和35 d耳緣靜脈采全血約2 m L置于EDTA K2抗凝管中，輕輕搖勻，配平后放入低溫離心機(jī)，1610×g離心10 m in后取上清液，用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定血漿中的汞含量；于相同時間節(jié)點(diǎn)采集兔尿液，尿液采集前12 h禁食，給與足夠的飲用水，麻醉后仰臥位固定，充分暴露外陰，碘伏消毒外生殖器，將涂有石蠟油的導(dǎo)尿管從家兔的尿道插入，而后向下緩慢推進(jìn)，插入6～7 cm即可進(jìn)入膀胱，留取1.5 m L尿液，用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定尿液中的汞含量。

1.6 ELISA法測定NSE和S100B濃度

分別于染毒前及染毒后0，7，14，21，28和35 d耳緣靜脈采全血約2 m L，置于離心管中，靜置1 h，配平后放入低溫離心機(jī)，1610×g，離心10m in后取上清液，采用雙抗體夾心ELISA法測定NSE和S100B濃度。

1.7 HE染色觀察注射部位病理變化

待Hg在局部無明顯擴(kuò)散后處死全部幼兔，留取局部注射部位組織，4%多聚甲醛固定，流水沖洗后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟浸透包埋，涂片、切片、烤片，HE染色，染色后脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察局部病理變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 幼兔肌內(nèi)注射Hg一般狀況觀察

正常對照組幼兔一般狀態(tài)良好，進(jìn)食、毛發(fā)、雙耳皮溫和顏色、精神狀態(tài)和尿便性狀均未見明顯異常，局部注射部位未見紅腫、結(jié)節(jié)、潰瘍或膿腫形成，未見分泌物增多、步態(tài)不穩(wěn)、行動障礙、痙攣或易激惹等癥狀；Hg 700mg·kg-1組在染毒后14 d開始出現(xiàn)輕度腹瀉、進(jìn)食減少和反應(yīng)差；1400m g·kg-1組在染毒后10 d開始出現(xiàn)輕度腹瀉、進(jìn)食減少和反應(yīng)差，1只兔在給藥后第4周出現(xiàn)嚴(yán)重的皮膚黏膜蒼白；2800 mg·kg-1組在染毒后7 d開始出現(xiàn)輕度腹瀉、進(jìn)食減少和反應(yīng)差。所有實(shí)驗(yàn)組幼兔在染毒后21 d開始陸續(xù)出現(xiàn)易激惹和分泌物增多，未見步態(tài)不穩(wěn)、行動障礙及痙攣等表現(xiàn)，部分在染毒后21～28 d在局部注射部位可見結(jié)節(jié)和膿腫形成，未見潰瘍，少數(shù)伴有皮溫升高和波動感。染毒組幼兔尿液性狀、毛發(fā)和四肢均未見異常。

2.2 幼兔肌內(nèi)注射Hg對體質(zhì)量的影響

所有幼兔在受試期間體質(zhì)量均持續(xù)增長，但增長的幅度各不相同。正常對照組體質(zhì)量增長最多，Hg 700和1400 mg·kg-1組體質(zhì)量增長較少，2800 mg·kg-1組體質(zhì)量增長最少，且自染毒后21 d起2800mg·kg-1組體質(zhì)量明顯低于對照組（P<0.05），但700和1400 mg·kg-1組體質(zhì)量與正常對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，3個劑量組之間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1）。

2.3 幼兔肌內(nèi)注射Hg注射部位局部X線表現(xiàn)

在局部注射部位X線片上可見大量形態(tài)不規(guī)則的高密度影，染毒劑量越大，高密度影的強(qiáng)度和面積越大。觀察不同時間Hg在局部的擴(kuò)散發(fā)現(xiàn)，在im Hg后的前28 d，Hg擴(kuò)散速度較快（圖2：0 d→7 d→14 d→21 d→28 d），且擴(kuò)散形態(tài)較規(guī)整；染毒后35 d局部X線擴(kuò)散形態(tài)與染毒后28 d相比無明顯變化（圖2：28 d→35 d）；提示在im Hg后約28 d局部病理包裹可能已形成。

Fig.1 Effect of intram uscular in jection m etallic m ercury（Hg）on body m ass in young rabbits.Young rabbits were treated with Hg 700，1400 and 2800 m g·kg-1 at 0 d and the body m ass was recorded at 7，14，21，28 and 35 d a fter Hg exposure，respectively.x±s，n=5.＊P<0.05，compared with norm al contro lgroup.

2.4 幼兔肌內(nèi)注射Hg后血汞和尿汞水平

與正常對照組相比，Hg 700，1400和2800mg·kg-1組血汞和尿汞水平在染毒后7，14，21，28和35 d明顯升高（P<0.01），且染毒劑量越大，血汞和尿汞濃度越高。但染毒后35 d血汞和尿汞升高的速度較前28 d減慢。與正常對照組相比，在染毒后7，14，21，28和35 d，Hg 700mg·kg-1組血汞升高倍數(shù)分別為64.2，95.2，189.5，215.6和194.0倍，1400mg·kg-1組血汞升高倍數(shù)分別為189.6，191.0，343.4，345.2和330.9倍，2800 mg·kg-1組血汞升高倍數(shù)分別為237.3，394.9，590.6，634.8和588.2倍；700 mg·kg-1組尿汞升高倍數(shù)分別為31.6，70.1，138.7，248.6和272.8倍，1400 mg·kg-1組尿汞升高倍數(shù)分別為60.4，99.4，258.2，354.7和400.0倍，2800mg·kg-1組血汞升高倍數(shù)分別為74.8，161.8，553.3，1100.0和1095.2倍。Hg 700，1400和2800 mg·kg-1組血汞和尿汞水平自染毒后7 d起每兩組間均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01，圖3）。

Fig.2 X-ray performance of local in jection site after in tram uscu lar in jec tion of Hg in young rabbits.See Fig.1 for the treatment.Red arrows show the Hg in jected into the m uscle.

Fig.3 Effect of intram uscular injection of Hg on m ercury level in b lood and u rine in young rabbits.See Fig.1 for the treatment.x±s，n=5.＊＊P<0.01，compared with normal control group.

2.5 幼兔肌內(nèi)注射Hg對血清NSE和S100B水平的影響

與正常對照組相比，Hg 700和1400 mg·kg-1組血清NSE在染毒后28 d開始持續(xù)升高（P<0.05），2800 mg·kg-1組在染毒后21 d開始明顯升高（P<0.05），Hg 700，1400和2800 mg·kg-1染毒組組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4）。

與正常對照組相比，Hg 700，1400和2800mg·kg-1組血清S100B分別在染毒后28，21和14 d開始顯著升高（P<0.01），2800 mg·kg-1組血清S100B在染毒后14 d開始顯著高于700和1400 mg·kg-1組（P<0.01，P<0.05），1400 mg·kg-1組血清S100B在染毒后21 d開始顯著高于700 mg·kg-1組（P<0.01）（圖5）。

Fig.4 Effect of intramuscu lar injection of Hg on serum neu ron-specific eno lase（NSE）in young rabbits.See Fig.1 for the treatm ent.，n=5.＊P<0.05，＊＊P<0.01，com pared with norm alcontrolgroup.

Fig.5 Effect of intram uscu lar in jection of Hg on serum S100B in young rabbits.See Fig.1 for the treatment.，n=5.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with normal control group;##P<0.01，compared with 700mg·kg-1 group;△P<0.05，compared with 1400 mg·kg-1 group.

2.6 幼兔肌內(nèi)注射Hg局部注射部位解剖和病理組織學(xué)改變

部分幼兔在染毒后約21 d，局部注射部位可觸及硬節(jié)和膿腫形成；染毒后35 d，Hg 700，1400和2800 mg·kg-1組局部注射部位解剖可見膿性包裹形成，包膜完整，切開后可見大量膿性物質(zhì)和多發(fā)散在的銀白色Hg滴（圖6）。組織學(xué)觀察可見大量含有Hg滴的微小膿腫，Hg滴周圍可見大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和少量泡沫細(xì)胞浸潤，部分小血管增生、充血及出血。部分區(qū)域壞死伴肉芽組織形成（圖7）。

Fig.6 Anatom ical changes in local injection site of intramuscular injection of Hg in young rabbits.Young rabbits were treated with Hg 700（A），1400（B）and 2800 mg·kg-1（C）at 0 d and the tissue of local injection site was taken at 35 d after Hg exposure.Red arrows show large complete abscesse and numerous，tiny，glistening droplets ofmetallic mercury.Left：complete pathological inclusion body;Right：large am ountof unoxidiced Hg droplets.

Fig.7 Histo logical changes in local in jection site of intramuscu lar in jection of Hg in young rabbits by HE staining.See Fig.6 for the treatment.Red arrows in A（ Hg 700 m g·kg-1）and B （1400 m g·kg-1）show clusters ofm icroabscesses containing m ultip le scattered mercury d rop lets surrounded with num erous neutrophils，macrophages and a few m ultinucleate foreign body giant cells.Hyperp lasia，hyperem ia and hem orrhage in sma ll vessels a lso could be seen in this area.Red arrows in C（Hg 2800 m g·kg-1）show granulom atous response.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，Hg經(jīng)im進(jìn)入機(jī)體后引起的病理變化與其他途徑染毒存在差異，絕大部分在局部產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)非特異炎性病理改變和組織包裹的結(jié)局。部分汞經(jīng)細(xì)胞攝取進(jìn)入血液，進(jìn)而隨血液循環(huán)運(yùn)送至腦、肺、肝、腎和腸道等器官，與含有巰基的蛋白質(zhì)或酶形成絡(luò)合物沉積在體內(nèi)，引起腹瀉、進(jìn)食減少、反應(yīng)差、易激惹、分泌物增多及貧血等相關(guān)表現(xiàn)，與國內(nèi)外的研究結(jié)果相近［16-17］。但幼齡動物的發(fā)育特性表明，汞中毒后中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷更加明顯、發(fā)生時間更早。汞透過血腦屏障入腦后，主要沉積在含有大量巰基、氨基和羧基的腦干神經(jīng)核團(tuán)的大、中型細(xì)胞質(zhì)和小腦浦肯野細(xì)胞層中，通過脂質(zhì)過氧化損傷激活星形膠質(zhì)細(xì)胞、升高細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度、耗竭乙酰膽堿、升高軸突間隙中興奮性氨基酸（如谷氨酸和天冬氨酸）水平和促進(jìn)一氧化氮合成發(fā)揮神經(jīng)毒性作用［18］。有研究表明，兒童期Hg暴露可能導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育性疾病，如自閉癥、焦慮和抑郁等［19］，長期低水平的Hg暴露還可引起廣泛的學(xué)習(xí)記憶障礙［20］。NSE特異性存在于神經(jīng)元胞質(zhì)中，當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞膜功能與結(jié)構(gòu)受損時，可大量釋放至腦脊液和血液中，是顱腦損傷和神經(jīng)元功能損傷的重要指標(biāo)［21］。星形膠質(zhì)源性蛋白S100B主要存在于哺乳動物的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞形態(tài)中有著重要作用［22］。當(dāng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷時，可釋放大量S100B到腦脊液和血液中，且血清含量與腦脊液含量有良好相關(guān)性，可用于評判血腦屏障和膠質(zhì)細(xì)胞的損傷程度［23］。同時NSE和S100B也在體外研究中用于評估無機(jī)汞的神經(jīng)毒性［24］，在兒童汞中毒CNS損傷的血清學(xué)變化研究中也有S100B和NSE升高的報(bào)道［25］。本研究通過對血清NSE和S100B濃度的檢測發(fā)現(xiàn)，NSE在汞中毒出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后開始明顯升高，升高的程度與中毒劑量關(guān)系不甚密切；血清S100B在汞中毒出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀前就已明顯升高，且有中毒劑量依賴性，中毒劑量越大，血清S100B濃度越高。進(jìn)而表明S1001B能用于更好地評價(jià)汞中毒后中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的程度，從而為遠(yuǎn)期隨訪提供可參考的依據(jù)。

Hg經(jīng)im進(jìn)入機(jī)體后遠(yuǎn)處擴(kuò)散的能力也是有限的，約4周可在局部形成異物組織包裹。大體可見結(jié)節(jié)和膿腫形成，解剖學(xué)可見完整的病理包裹，組織學(xué)HE染色可見多發(fā)含Hg滴的微小膿腫，圍繞汞滴可見大量中性粒細(xì)胞、多核巨噬細(xì)胞和少量的異物巨細(xì)胞，同時還可見到肉芽組織形成，符合無菌性炎癥反應(yīng)的改變。在病理包裹形成后，血汞濃度升高的速度也隨之減慢。該發(fā)現(xiàn)提示，在治療大劑量注射汞中毒時，在不危及生命的情況下，可先試行螯合劑驅(qū)Hg治療。如組織包裹形成之前過早手術(shù)治療不僅切除不徹底，而且會導(dǎo)致Hg的進(jìn)一步擴(kuò)散進(jìn)而影響治療效果。應(yīng)待病理包裹形成后再行外科手術(shù)治療為宜，從而能較徹底清除體內(nèi)的Hg，減少多次手術(shù)的機(jī)會和術(shù)中二次吸收的可能。

因此，Hg經(jīng)皮進(jìn)入皮下及肌肉暴露后，不僅造成局部的病理變化，而且會播散至全身造成多器官受累。通過X片觀察Hg在局部擴(kuò)散的變化，發(fā)現(xiàn)在注射金屬后約4周可形成局部異物包裹，這為臨床手術(shù)治療的時機(jī)提供參考。幼齡動物汞中毒后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷尤為突出，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞功能的生化標(biāo)志物異常，這為兒童汞中毒神經(jīng)系統(tǒng)損傷評價(jià)和隨訪提供參考，同時也為進(jìn)一步研究采用手術(shù)取Hg及螯合劑驅(qū)Hg聯(lián)合治療的時機(jī)及療程提供理論指導(dǎo)及實(shí)踐依據(jù)。