范喜杰，張 欣，張 發(fā)，楊曉燕*

(1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 671000；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003；3.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南 大理 671003)

捕食線蟲(chóng)真菌(Nematode-trapping fungi)是一類以營(yíng)養(yǎng)菌絲特化形成黏性捕食器官(黏性菌網(wǎng)、非收縮環(huán)、黏球和黏性分枝)及機(jī)械捕食器官(收縮環(huán))捕食線蟲(chóng)的真菌[1―2]。由于該類真菌在形態(tài)和生態(tài)功能上的特殊性及其在線蟲(chóng)生物防治中的潛在價(jià)值，逐漸成為微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[3―5]。捕食線蟲(chóng)真菌廣泛分布于世界各地，甚至在南極[6]、熱泉[7]和重金屬污染區(qū)[8]等極端環(huán)境中都有分布。到目前為止，絕大部分研究都集中在陸生環(huán)境中的捕食線蟲(chóng)真菌[9―11]，對(duì)于水環(huán)境中捕食線蟲(chóng)真菌的研究相對(duì)較少[12―14]。目前全世界已知的2萬(wàn)多種線蟲(chóng)，有許多生活在水環(huán)境中[15]，水體中豐富的線蟲(chóng)種類必定伴隨著豐富的水生捕食線蟲(chóng)真菌的存在。從已有文獻(xiàn)報(bào)道可知水體中水生真菌資源豐富，生物多樣性極高[16,17]。

眾所周知，溫泉是一種特殊的水生環(huán)境，廣泛分布于全球各地。由于溫泉與地球早期環(huán)境比較接近，溫泉中的微生物生態(tài)系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定和封閉。同時(shí)，在數(shù)千萬(wàn)年的進(jìn)化歷程中，溫泉微生物已經(jīng)具備獨(dú)特的生存適應(yīng)能力，這些微生物所具有的特殊生理機(jī)制和蘊(yùn)涵的獨(dú)特基因資源，產(chǎn)生的酶或其他代謝產(chǎn)物及其在生命起源和生物進(jìn)化過(guò)程中所處的特殊地位，已經(jīng)受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[18―20]。如：有研究者從美國(guó)黃石公園溫泉中分離得到嗜熱細(xì)菌Thermusaquaticus[21]，從云南騰沖溫泉中分離得到硫化葉菌Sulfolobustengchongensis[22]，從冰島溫泉中分離得到氫氧化細(xì)菌Hydrogenophilusislandicus[23]，這些皆表明溫泉中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源。而目前對(duì)溫泉中微生物資源的研究主要針對(duì)放線菌、嗜熱真菌、細(xì)菌和古生菌等，國(guó)內(nèi)外僅Hu等[24]報(bào)道過(guò)一株溫泉食線蟲(chóng)真菌(Arthrobotrysmultisecundaria)，該菌分離自云南騰沖溫泉，表明溫泉捕食線蟲(chóng)真菌資源還未引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。云南省溫泉資源非常豐富，是中國(guó)地?zé)豳Y源最豐富的地區(qū)之一，所以本研究對(duì)大理州人為干擾較少的溫泉進(jìn)行捕食線蟲(chóng)真菌資源調(diào)查，了解溫泉中捕食線蟲(chóng)真菌資源的分布狀況，分離、鑒定和保存溫泉捕食線蟲(chóng)真菌資源，為捕食線蟲(chóng)真菌的起源和進(jìn)化研究提供菌種資源。

1.材料和方法

1.1 樣品采集

2012年3―5月，采集大理市、祥云縣、彌渡縣、劍川縣、漾濞縣的溫泉底泥共105份，樣品于4℃保存，7d內(nèi)處理完所有采回的泥土樣品。樣品采集的同時(shí)測(cè)定溫泉pH值和溫度。

表1 各溫泉基本信息

1.2 CMA培養(yǎng)基的制備

玉米粉20g，瓊脂18g，水1000mL，自然pH。玉米粉加水適量煮沸30min，四層紗布過(guò)濾，濾液加水至1000mL，混勻，分裝，121℃高溫滅菌30min[25]。

1.3 誘餌線蟲(chóng)的制備

采用貝爾曼漏斗法[26]制備：即取少許全齒復(fù)活線蟲(chóng)Panagrellusredivivus放于四層擦鏡紙上置于漏斗(漏斗通過(guò)軟管與收集管相接)，加適量無(wú)菌水，擠壓軟管排出氣泡，靜置一定時(shí)間，直至濾出物達(dá)到需要量，加無(wú)菌水清洗線蟲(chóng)，使線蟲(chóng)濃度約為5×103條/mL。

1.4 捕食線蟲(chóng)真菌的培養(yǎng)、分離與鑒定

采用常規(guī)撒土法培養(yǎng)[27]，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，撒樣后在平板中加入上述線蟲(chóng)懸液1ml(約5000條)，室溫下誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后在體視鏡下進(jìn)行鏡檢，將鏡檢到的菌株轉(zhuǎn)接到CMA平板上，并在培養(yǎng)基中間挖一個(gè)2×2 cm2的觀察室，在30℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5―7d，待觀察室長(zhǎng)滿菌絲后加入誘餌線蟲(chóng)，培養(yǎng)12―24h后進(jìn)行鏡檢，觀察捕器的產(chǎn)生情況[28]。根據(jù)孢子著生方式、孢子梗形態(tài)、孢子形態(tài)及捕器類型等特征采用Li等[29―30]分類系統(tǒng)對(duì)捕食線蟲(chóng)真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

檢出頻率(OF)：OF = 某個(gè)種出現(xiàn)的土樣數(shù)/總的土樣數(shù)×l00% 。

Ni為第i種的數(shù)量;N為所有種的數(shù)量;Pi為第i個(gè)種所占百分?jǐn)?shù);S為采樣點(diǎn)的物種。

2.結(jié)果

從大理州溫泉中共分離到2屬14種捕食線蟲(chóng)真菌，其中Arthobotrys12個(gè)種，Dactylellina2個(gè)種；在祥云縣的大波那溫泉中分離出一個(gè)新種(A.xiangyunensis,sp.nov)[32]；A.musiformis為溫泉捕食線蟲(chóng)真菌的優(yōu)勢(shì)種(檢出率為26.92%)。彌渡縣的彌渡溫泉中捕食線蟲(chóng)真菌多樣性較高，為0.99，其次為祥云縣的大波那溫泉(0.69)；產(chǎn)黏性菌網(wǎng)的捕食線蟲(chóng)真菌占總檢出的86.54%(表2)。

表2 溫泉底泥中捕食線蟲(chóng)真菌資源調(diào)查結(jié)果

3.討論

本研究從大理溫泉中共分離、鑒定出2屬14種捕食線蟲(chóng)真菌，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新種(A.xiangyunensissp.nov)[32]，表明大理溫泉中存在較為豐富的捕食線蟲(chóng)真菌資源。在調(diào)查的溫泉中，各溫泉(包括縣內(nèi)的溫泉之間)檢出種皆不同，其主要原因可能是：溫泉作為與地球早期生境最為接近的一種特殊生境，其中保留了最為原始的菌種資源[21―23,33,34]，在地球生物演化的過(guò)程中受到的人為干擾較少，使得空間距離上較為接近的溫泉之間保留了各自的特有物種。同時(shí)，各溫泉間的生境差異，如pH和溫度的差異，也可能會(huì)導(dǎo)致生活在其中的菌種的不同。捕食線蟲(chóng)真菌的最適生長(zhǎng)溫度為25―28℃，而本次調(diào)查的溫泉溫度范圍為29―64.2℃, 表明捕食線蟲(chóng)真菌的溫度適應(yīng)能力也存在菌株差異，這種差異由遺傳物質(zhì)導(dǎo)致。因此，對(duì)溫泉捕食線蟲(chóng)真菌菌種資源的發(fā)掘可獲得常規(guī)生境中捕食線蟲(chóng)真菌沒(méi)有的基因資源。隨著人類對(duì)溫泉的開(kāi)發(fā)加劇[35―37]，分布其中的獨(dú)特的菌種資源也必將受到影響，因此盡快發(fā)掘和保存溫泉菌種資源是一項(xiàng)很迫切的研究工作，同時(shí)，應(yīng)當(dāng)從政府層面加強(qiáng)對(duì)溫泉資源的保護(hù)。A.musiformis在大理溫泉中的檢出率最高，是大理溫泉中捕食線蟲(chóng)真菌的優(yōu)勢(shì)種群；A．oligospora在其中檢出率較低，且僅在大理市的大壩溫泉中有檢出，但已有文獻(xiàn)報(bào)道A．oligospora是不同生境土壤中的優(yōu)勢(shì)種群[6, 38,39]，表明不同生境中捕食線蟲(chóng)真菌的分布存在一定差異，產(chǎn)相同捕食器官的捕食線蟲(chóng)真菌也存在環(huán)境適應(yīng)能力的差異。

據(jù)化石記錄顯示，食肉類真菌大約起源于1億年前的中生代，在當(dāng)時(shí)，這個(gè)古老的類群主要營(yíng)腐生生活，但在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷史中，其菌絲體為適應(yīng)生存環(huán)境(如氮源缺乏)，可變態(tài)為各種形態(tài)獨(dú)特、結(jié)構(gòu)精巧的捕食器官捕食線蟲(chóng)[40,41]。因此，捕食器官的進(jìn)化也就成為該類真菌進(jìn)化的主要特征之一，不同基于捕食器官形態(tài)、捕食率和分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特性的進(jìn)化假說(shuō)也相繼被提出[25,30,42―45]。但在這些假說(shuō)中，各捕器類型的進(jìn)化地位也各不相同，甚至完全相反，如：李天飛等[25]和Yangetal.,[43]提出黏性菌網(wǎng)是一種比較古老、進(jìn)化地位低且捕食率也較低的捕器類型，但Lietal[30]、Rubner[44]和Enceetal.[45]則認(rèn)為黏性菌網(wǎng)是一種進(jìn)化地位比較高且捕食率也較高的捕器類型。林慧彪等[46]對(duì)產(chǎn)不同捕器類型的捕食線蟲(chóng)真菌進(jìn)行捕食率的定量測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)黏性菌網(wǎng)的捕食線蟲(chóng)真菌的捕食率相較產(chǎn)其他捕器類型的捕食線蟲(chóng)真菌低，而本研究結(jié)果也顯示產(chǎn)黏性菌網(wǎng)的捕食線蟲(chóng)真菌為大理溫泉中的優(yōu)勢(shì)種群，考慮到溫泉生境的特殊性，產(chǎn)黏性菌網(wǎng)的捕食線蟲(chóng)真菌可能更原始。