吳亞柳， 馬 玉， 于曼麗， 王文棟， 郝 敏， 常曉彤

(河北北方學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 張家口 075000)

胰島素抵抗(insulin resistance)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)代謝組織、多種調(diào)控因子和多條信號(hào)通路的交互作用[1]。微小RNA(microRNAs，miRNAs,miR)是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA分子，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。已有研究表明，多種胰島素作用的靶組織如胰腺、脂肪及肝臟組織等miRNAs表達(dá)譜發(fā)生改變[2-4]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)是機(jī)體蛋白質(zhì)降解的主要途徑，可靶向降解胰島素和炎癥等相關(guān)信號(hào)通路的信號(hào)分子，阻斷其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，直接或間接影響機(jī)體糖脂代謝[1]。目前，關(guān)于胰島素信號(hào)通路、UPS和miRNAs三者之間是否存在交互作用尚無(wú)報(bào)道。

本課題組前期通過(guò)基因芯片篩選出高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗小鼠肝臟組織mmu-miR-7a-5p(MIMAT0000677)顯著下調(diào)[5]。經(jīng)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http://microrna.sanger.ac.uk)分析證實(shí)，mmu-miR-7a-5p與人類hsa-mir-7-5p(MIMAT0000252)同源性可達(dá)100%。生物信息學(xué)分析表明，其預(yù)測(cè)靶基因較多的富集于UPS，其中E3泛素連接酶Itch可與磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA)直接相互作用，降低胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的p110催化亞基的生成，直接影響胰島素信號(hào)通路重要分支PI3K-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前關(guān)于miR-7-5p對(duì)Itch蛋白表達(dá)的調(diào)控作用及其與胰島素抵抗的相關(guān)性尚無(wú)報(bào)道。為此，本研究基于miR-7-5p在多個(gè)物種間的同源性，建立軟脂酸(palmitic acid，PA)誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞HepG2胰島素抵抗模型，檢測(cè)miR-7-5p及其預(yù)測(cè)靶基因Itch的表達(dá)變化，探討miR-7-5p對(duì)Itch基因的靶向作用及其與胰島素抵抗的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)自上海滬震生化有限公司。

2 主要試劑和儀器

DMEM低糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；軟脂酸和胰島素購(gòu)自Sigma；不含脂肪酸的牛血清白蛋白和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；總RNA提取試劑TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑FastQuant RT Kit (With gDNase)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑SuperReal PreMix Plus (SYBR GreenⅠ)均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒(葡萄糖氧化酶法)購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司；尼羅紅購(gòu)自MCE；CCK-8試劑盒和Hoechst 33258 染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；抗Itch抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo； Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自QIAGEN；Omega Lum G凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自環(huán)亞生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)于含10%胎牛血清，1‰青、鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶2比例傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

3.2軟脂酸溶液的配制 準(zhǔn)確稱取51.3 mg軟脂酸加入5 mL 40 mmol/L NaOH溶液，70 ℃水浴加熱，振蕩至液體澄清，配制成40 mmol/L的PA溶液。將1 mL 40 mmol/L的PA溶液緩慢溶于19 mL 10%不含脂肪酸的牛血清白蛋白溶液中，配制成2 mmol/L PA母液，針筒濾器過(guò)濾除菌。用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基按比例稀釋成不同濃度的PA處理液。

3.3HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，接種到相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板中。選定生長(zhǎng)24～48 h之間的細(xì)胞[6-7]，給予不同濃度的PA誘導(dǎo)，以確定使其產(chǎn)生胰島素抵抗的最適宜PA濃度。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和3個(gè)胰島素抵抗實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)平行孔?？瞻讓?duì)照組不加細(xì)胞只含有DMEM低糖培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組為不加PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞，3個(gè)胰島素抵抗組是濃度分別為0.25、0.50和0.75 mmol/L PA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞。

3.4CCK-8法檢測(cè)PA對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，并調(diào)整其細(xì)胞密度為5×107/L，每孔100 μL接種于96孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次。陰性對(duì)照(control)組只加入細(xì)胞培養(yǎng)液，處理組加入含有不同濃度(0.25、0.50和0.75 mmol/L)PA的處理液，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h。以加了相應(yīng)量的細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照(blank)組，酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)。細(xì)胞活力(%)=(處理組A值-空白對(duì)照組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。

3.5葡萄糖氧化酶法檢測(cè)各組細(xì)胞葡萄糖消耗量 同理將細(xì)胞密度為5×107/L的細(xì)胞培養(yǎng)液接種于24孔板，每孔500 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h。細(xì)胞分組與軟脂酸處理如前所述，PA處理液誘導(dǎo)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入含有1×10-9mol/L胰島素的正常培養(yǎng)液孵育12 h。以加入相應(yīng)量的細(xì)胞培養(yǎng)液但沒(méi)有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量，計(jì)算各組細(xì)胞葡萄糖消耗率。葡萄糖消耗率(%)=(空白對(duì)照組葡萄糖含量-各組細(xì)胞上清液葡萄糖含量)/空白對(duì)照組葡萄糖含量×100%。

3.6尼羅紅染色觀察HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，每孔2 mL接種到6孔板內(nèi)的爬片上。按上述細(xì)胞模型建立的方法進(jìn)行不同的處理后，棄去培養(yǎng)基，用PBS液洗滌3遍。用固定液固定細(xì)胞10 min，PBS搖床洗滌2遍，每次3 min，每孔加入0.5 mL尼羅紅染液，室溫?fù)u床避光染色20 min，PBS搖床洗滌2遍，每次3 min；每孔加入0.5 mL Hoechst染液，室溫?fù)u床避光染色5 min，PBS搖床洗滌2遍，每次3 min；晾干后用熒光抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

3.7RT-qPCR檢測(cè)miR-7-5p的表達(dá)差異 在HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型建立的基礎(chǔ)上，運(yùn)用課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法[5]，即TRIzol法提取HepG2細(xì)胞總RNA，經(jīng)FastQuant RT Kit (With gDNase)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用SYBR GreenⅠ熒光定量試劑盒檢測(cè)miR-7-5p的表達(dá)情況。miR-7-5p所用莖環(huán)引物為5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG-GATACGACACAACA-3’，上游引物為5’-GTGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTGT-3’，下游引物為5’-CGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’，內(nèi)參照U6的上游引物為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3’，下游引物為5’-TGGAACGCTTCACGAATTTG-3’。反應(yīng)體系為20 μL，條件為95 ℃ 15 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s、61 ℃ 20 s、72 ℃ 27 s采集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參照，2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

3.8生物信息學(xué)分析 利用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.targetscan.org/vert-50/)和miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mirdb.org/miRDB/)共同預(yù)測(cè)miR-7-5p的靶基因，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.kegg.jp/)分析差異表達(dá)的miR-7-5p靶基因可能富集的生物學(xué)信號(hào)通路。STRING 10.0(http://www.string-db.org/)對(duì)預(yù)測(cè)靶基因與胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相互作用進(jìn)行分析。

3.9RT-qPCR檢測(cè)miR-7-5p預(yù)測(cè)靶基因Itch轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異 方法同3.7，利用Itch基因的上游引物5’-GAATATGCAGGGAAGGATAACTACT-3’和下游引物5’-CAACTGGTTTGTTCAAGATACGC-3’，采用SYBR GreenⅠ熒光定量試劑盒檢測(cè)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下HepG2細(xì)胞中Itch mRNA的表達(dá)差異。

3.10Western blot檢測(cè)miR-7-5p預(yù)測(cè)靶基因Itch翻譯水平的表達(dá)變化 用RIPA裂解液提取胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下HepG2細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，取100 μg的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)8% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)。恒壓13 V，濕轉(zhuǎn)12 h，將分離后的目的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉過(guò)夜。然后加入兔抗人Itch抗體(1 ∶200)，4 ℃過(guò)夜。用PBS/PBST洗膜后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1 ∶2 000)，室溫?fù)u床孵育1 h，經(jīng)PBS/PBST再次洗膜后加入ECL發(fā)光液曝光顯影，分析灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間的差異用Student’st檢驗(yàn)分析，兩組以上的組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型建立

1.1不同濃度PA對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響 與正常對(duì)照組相比，0.25 mmol/L PA作用于HepG2細(xì)胞24 h，對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有明顯的抑制作用；但當(dāng)PA濃度由0.50 mmol/L增大至0.75 mmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生明顯的抑制作用，細(xì)胞數(shù)目減少，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞損傷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

1.2不同濃度PA對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗率的影響 與陰性對(duì)照組相比，PA濃度由0.25 mmol/L增加到0.75 mmol/L時(shí)，處理組細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗率逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，PA濃度為0.75 mmol/L時(shí)培養(yǎng)基中葡萄糖消耗率達(dá)到最低，提示經(jīng)PA誘導(dǎo)后，HepG2細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性下降，葡萄糖利用降低，產(chǎn)生了胰島素抵抗，見(jiàn)表1。

1.3尼羅紅染色觀察HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)堆積情況 不同濃度的PA作用于HepG2細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的脂滴經(jīng)尼羅紅染成鮮紅色，細(xì)胞核經(jīng)Hoechst染成深藍(lán)色。正常細(xì)胞胞質(zhì)中僅見(jiàn)少量較小脂滴，處理組細(xì)胞隨著PA濃度的增加，胞質(zhì)內(nèi)堆積的鮮紅色脂滴逐漸增多、增大，見(jiàn)圖1。

表1不同濃度軟脂酸對(duì)HepG2細(xì)胞活力和葡萄糖消耗率的影響

Table 1. The effects of PA at different concentrations on the viability and glucose consumption of HepG2 cells (Mean±SD.n=3)

GroupA450Cellviability(%)Glucose▲(mmol/L)Glucoseconsumptionrate(%) Control2．3700±0．0184100%3．2767±0．075747．19% Blank0．1135±0．002106．2050±0．03540 0．25mmol/LPA2．2725±0．031895．68%3．6633±0．0635??40．96% 0．50mmol/LPA2．1535±0．0276?90．40%3．9200±0．0624??36．82% 0．75mmol/LPA1．8245±0．0304??75．82%4．3700±0．0854??29．57%

▲the glucose concentration in the culture supernatant of the HepG2 cells;*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Figure 1. Lipid accumulation in the cytoplasm of HepG2 cells treated with different concentrations of PA (Nile red staining, ×400).

圖1不同濃度PA作用于HepG2細(xì)胞后胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)堆積情況

綜上所述，與正常對(duì)照組相比，當(dāng)0.25 mmol/L PA作用于HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力較好，對(duì)葡萄糖利用率降低，胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)堆積增加，所以當(dāng)PA作用時(shí)間為24 h時(shí)，誘發(fā)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗最適宜的濃度為0.25 mmol/L。

2 miR-7-5p在胰島素抵抗HepG2細(xì)胞中顯著下調(diào)

分別從正常HepG2細(xì)胞和經(jīng)0.25 mmol/L PA干預(yù)24 h后的HepG2細(xì)胞中抽提總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄總RNA，用miR-7-5p特異性引物進(jìn)行RT-qPCR。結(jié)果顯示，miR-7-5p在HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型中的表達(dá)水平顯著低于正常HepG2細(xì)胞(P<0.01)，見(jiàn)表2。這提示miR-7-5p可能參與了HepG2細(xì)胞胰島素抵抗過(guò)程。

表2胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下HepG2細(xì)胞中miR-7-5p和ItchmRNA表達(dá)的相對(duì)定量結(jié)果

Table 2. The relative quantitative results of miR-7-5p and Itch mRNA expression in the HepG2 cells with insulin resistance (ΔCt. Mean±SD.n=3)

GroupmiR?7?5pItchmRNA Control-3．480±0．2159．532±0．312 Insulinresistance-2．510±0．448??9．470±0．166

**P<0.01vscontrol group.

3 生物信息學(xué)分析

經(jīng)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)miR-7-5p在不同的物種間具有較好的同源性，見(jiàn)圖2。對(duì)TargetScan和miRDB預(yù)測(cè)出的miR-7-5p靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，miR-7-5p的靶基因富集于多條與胰島素抵抗相關(guān)的信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、Toll樣受體(Toll-like reporters，TLRs)信號(hào)通路及2型糖尿病信號(hào)通路等。值得注意的是，其中有相當(dāng)數(shù)量的靶基因富集于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)。蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)表明E3泛素連接酶Itch可與胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白PIK3CA直接相互作用。E3泛素連接酶Itch在不同物種間具有較好的同源性，且預(yù)測(cè)分值較高，miR-7-5p與Itch 3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)的結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖3。

Figure 2. The homology of miR-7-5p in different species.

圖2不同物種間miR-7-5p同源性比對(duì)

Figure 3. The homology ofItchgene in different species and the binding site between miR-7-5p and Itch 3’-UTR.

圖3Itch基因在不同物種間的同源性及miR-7-5p與Itch3’-UTR的結(jié)合位點(diǎn)

4 胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下miR-7-5p預(yù)測(cè)靶基因Itch在翻譯水平表達(dá)上調(diào)

運(yùn)用RT-qPCR的方法檢測(cè)miR-7-5p預(yù)測(cè)靶基因Itch的mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示胰島素抵抗組中Itch基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與正常對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)表2。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示胰島素抵抗組中Itch基因在翻譯水平的表達(dá)量比正常對(duì)照組上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4。這提示miR-7-5p可能與Itch mRNA的3’-UTR種子序列結(jié)合，在翻譯水平影響Itch蛋白表達(dá)，從而參與胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展。

討 論

胰島素抵抗相關(guān)的信號(hào)通路作用網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，目前已知其病理機(jī)制涉及炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和腸道菌群失調(diào)[8]。研究表明，miRNAs作為一種調(diào)控的媒介，除了能作用于胰島素信號(hào)通路的各級(jí)信號(hào)分子，也廣泛參與了炎癥等相關(guān)信號(hào)通路介導(dǎo)的胰島素抵抗的發(fā)生。既有研究表明，高脂飲食小鼠體內(nèi)JNK1磷酸化的增強(qiáng)可導(dǎo)致miR-122表達(dá)下調(diào)，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B)是miR-122的直接靶蛋白，后者的表達(dá)升高可使胰島素受體(insulin receptor，IR)和胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS)酪氨酸殘基去磷酸化而抑制胰島素信號(hào)通路，誘導(dǎo)胰島素抵抗發(fā)生[9]；在線粒體功能失調(diào)的條件下，表達(dá)上調(diào)的miR-96也可直接靶向抑制IRS1，誘發(fā)胰島素抵抗，降低糖原合成[10]。

Figure 4. The expression of predictive target geneItchof miR-7-5p under insulin resistance. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下miR-7-5p預(yù)測(cè)靶基因Itch的蛋白表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型，在細(xì)胞水平證實(shí)胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下miR-7-5p表達(dá)下調(diào)，揭示miR-7-5p表達(dá)的改變與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展存在一定的相關(guān)性。Zhang等[11]應(yīng)用RNA-seq技術(shù)，比較第1天和第7天產(chǎn)后大鼠乳腺RNA樣本中的miRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)rno-miR-7a-5p表達(dá)下調(diào)，推測(cè)其可能參與了乳腺發(fā)育和功能的調(diào)節(jié)。在長(zhǎng)期缺氧的情況下，大鼠心臟δ-類鴉片活性肽受體的活化能使miR-7a-5p表達(dá)下調(diào)，揭示其可能與心臟缺氧/缺血性損傷相關(guān)[12]。Li等[13]的研究表明，miR-7a/b對(duì)于缺血/再灌注損傷是敏感的，并且通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)多聚ADP-核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP]的表達(dá)，在保護(hù)心肌細(xì)胞應(yīng)對(duì)I/R-誘導(dǎo)凋亡方面起到重要作用。目前，尚未看到miR-7-5p與胰島素抵抗的相關(guān)性報(bào)道。

我們通過(guò)對(duì)miR-7-5p的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和KEGG信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)有一定數(shù)量的靶基因富集于UPS。UPS可參與細(xì)胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)的降解，其功能的發(fā)揮有賴于3種酶的調(diào)控，分別為E1泛素活化酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶，其中E3泛素連接酶對(duì)底物蛋白的特異性識(shí)別是啟動(dòng)泛素化降解的關(guān)鍵步驟[14]。Itch是E3泛素連接酶HECT家族的成員，本研究結(jié)果表明，胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，Itch在翻譯水平表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)選擇性降解PIK3CA，抑制胰島素PI3K-Akt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。既有文獻(xiàn)報(bào)道Itch蛋白水平降低與胰島素抵抗?fàn)顩r改善相關(guān)。Itch-/-小鼠肝臟中，抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素13(interleukin-13，IL-13)表達(dá)增加，后者作用于肝臟IL-13Rα1/IL-4Rα，使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)磷酸化增強(qiáng)，進(jìn)而降低葡萄糖產(chǎn)量，抑制糖異生基因表達(dá)，改善了胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[15]。研究揭示，用高脂飲食喂養(yǎng)的Itch-/-小鼠，其脂肪組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞中抗炎的M2型巨噬細(xì)胞比例明顯增加，胰島素抵抗癥狀明顯改善[16]。但是在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，關(guān)于Itch的上游調(diào)控分子及其與胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的直接相互作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。

綜上所述，本研究以HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型為基礎(chǔ)，在細(xì)胞水平上首次證實(shí)miR-7-5p在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下顯著下調(diào)，并且初步驗(yàn)證了miR-7-5p與其預(yù)測(cè)靶基因Itch存在相互作用。該結(jié)果為研究胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制提供了一種新的可能。未來(lái)，需要通過(guò)雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-7-5p與Itch之間的直接靶向關(guān)系，并深入研究二者的生物學(xué)作用及其與胰島素抵抗的相關(guān)性。