李曉明， 歐陽婷庭, 董妙先， 崔 濤， 郭麗娜， 董 巍， 王曉麗

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

肝纖維化是由于肝臟對(duì)不同病因所致的慢性損害產(chǎn)生的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，是各種慢性肝臟疾病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，也是肝硬化-肝癌的必經(jīng)階段[1]。研究表明，肝纖維化以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度或異常沉積及降解不足為主要特征[2]。目前經(jīng)研究證實(shí)，肝纖維化經(jīng)過積極治療后是可逆的，因此，如何治療逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)而防治肝硬化-肝癌成為醫(yī)藥工作者的首要任務(wù)。 轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是目前致纖維化最強(qiáng)的因子之一，是促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的關(guān)鍵因子，而Smads家族蛋白是TGF-β信號(hào)傳遞的關(guān)鍵性蛋白，且不同的Smad介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3-4]。白屈菜為罌粟科白屈菜屬多年生草本植物白屈菜(ChelidoniummajusL.)全草，其化學(xué)成分主要有白屈菜堿(chelidonine)、白屈菜紅堿(chelerythrine)和原阿片堿(protopine)等,具有抗菌、鎮(zhèn)痛和興奮平滑肌的作用，目前臨床上主要用于治療胃痛、腸炎、慢性支氣管炎、百日咳、黃疸和疥癬瘡腫等。我們前期研究表明，白屈菜對(duì)小鼠肝纖維化具有一定的逆轉(zhuǎn)作用[5-6]。為進(jìn)一步研究其作用及其機(jī)制，本文以四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，探討白屈菜紅堿抗肝纖維化的作用及其對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)通路的調(diào)控作用。

材 料 和 方 法

1 藥物、試劑和儀器

白屈菜紅堿(中國食品藥品檢定研究院)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒(批號(hào)20171216)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)檢測試劑盒(批號(hào)20171220)和肝組織羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)檢測試劑盒(批號(hào)20171229)均購自南京建成生物工程研究所；透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)檢測試劑盒(批號(hào)201709，武漢默沙克生物科技有限公司)；Van Gieson(VG)染色試劑(批號(hào)20161121，北京索萊寶科技有限公司)；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒(批號(hào)P0028，碧云天生物技術(shù)公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit(批號(hào)BK4001)和SYBR Premix Ex TaqTMKit(批號(hào)AK2603)購自寶生物工程大連有限公司；TRIzol Reagent(批號(hào)47323，Am-bion)；TGF-β1、Smad3、Smad4和Smad7引物由上海生工生物工程有限公司合成；抗GAPDH抗體(批號(hào)106M4851V)、抗Smad4抗體(批號(hào)A114739)和抗Smad7抗體(批號(hào)061M4888)購自Sigma；II 抗(批號(hào)00051405，康為世紀(jì)公司)；ECL超敏發(fā)光檢測試劑盒(批號(hào)PH202434，Thermo Fisher Scientific)。

CKX41型倒置顯微鏡(Olympus)；Stratagene Mx3005P Real-time PCR儀(Agilent)；S1000TMThermal Cycler(Bio-Rad)；ELx800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BioTek)；JY-ZY2型轉(zhuǎn)移電泳槽和JY-CZ1型單垂直電泳槽(北京君意東方)；HL-2000分子雜交箱(UVP)；SmartChemi II一體式化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(北京賽智)；5417R型離心機(jī)(Eppendorf)；XPE504分析大平(Mettler Toledo)。

2 方法

2.1動(dòng)物、分組及造模 SPF級(jí)C57BL/6N小鼠50只(7～8周齡)，體重(35.0±2.0)g，雄性，購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(蘇)2015-0001。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，造模前禁食12 h，常規(guī)飲水，室溫20～25 ℃，12 h晝夜交替。小鼠隨機(jī)分成5組：正常對(duì)照組、模型組和白屈菜紅堿高、中、低(40 mg·kg-1·d-1、 20 mg·kg-1·d-1和 10 mg·kg-1·d-1)3個(gè)劑量組，每組各10只。除正常對(duì)照組外，其余各組均被制成四氯化碳橄欖油溶液誘導(dǎo)的肝纖維化-肝癌模型，造模方法按參考文獻(xiàn)[7]方法并加以改進(jìn)，首次以四氯化碳3 mL/kg腹腔注射，以后以 50%四氯化碳-橄欖油 3 mL/kg 體重腹腔注射，1周2次，共8周。白屈菜紅堿3個(gè)劑量組于造模后第5周開始分別每天灌胃給藥，直至第14周，其余組給予溶媒灌胃。

2.2樣品的采集與處理 第14周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，小鼠禁食不禁水1 d，稱量體重后麻醉取血，收集血清，備用；摘取并稱量肝臟，于冰上取右肝葉一小塊肝組織，用4%甲醛溶液固定24 h，用于病理學(xué)檢查；肝右葉其余部分，留存?zhèn)溆?；將肝左葉液氮速凍后，-80 ℃冰箱凍存，待提取組織進(jìn)行RT-qPCR和Western blot 檢測。計(jì)算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)(%)=肝臟重量/小鼠體重×100%。

2.3血清中AST、ALT和HA含量檢測 取備用血清，按試劑盒要求，檢測血清中AST、ALT和HA含量。

2.4肝組織羥脯氨酸含量的測定 取留存的部分肝葉，參照文獻(xiàn)處理方法[8]，按試劑盒要求，檢測肝組織中Hyp含量。

2.5肝組織HE和VG染色觀察 取經(jīng)甲醛溶液固定的小鼠肝組織，石蠟包埋，切片，二甲苯、多級(jí)乙醇脫蠟至水，分別用蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin,HE)法和苦味酸-酸性品紅(VG)法對(duì)肝組織切片進(jìn)行染色,并于顯微鏡下觀察小鼠肝組織的病理改變及肝纖維化的程度。

2.6RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測肝組織TGF-β1、Smad3、Smad4和Smad7的mRNA表達(dá) 取凍存肝組織，至室溫，用TRIzol試劑提取總RNA，按ExscriptTMRT reagent Kit說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照PCR Amplification Kit說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。TGF-β1的上游引物序列為5’-GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA-3’, 下游引物序列為5’-TTGGTTCAGCCACTGCCGTA-3’；Smad3的上游引物序列為5’-GTCAACAAGTGGTGGCGTGTG-3’，下游引物序列為5’-GCAGCAAAAGGCTTCTGGGATAA-3’；Smad4的上游引物序列為5’-TTGCTTGGGTCAACTCTCCA-3’，下游引物序列為5’-TCACCTTCACCTTTACATTTCCAAC-3’；Smad7的上游引物序列為5’-GTCCAGATGCTGTACCTTCCTC-3’，下游引物序列為5’-GCGAGTCTTCTCCTCCCAGTAT-3’；β-actin的上游引物序列為5’-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3’，下游引物序列為5’-CAGCCTGGATGGCTACGTACA-3’。數(shù)據(jù)分析用2-ΔΔCt法。

2.7Western blot 檢測肝組織中TGF-β1、Smad4和Smad7的蛋白表達(dá) 取凍存肝組織，至室溫，用組織蛋白裂解液提取組織總蛋白，加入上樣緩沖液，SDS-PAGE法進(jìn)行蛋白分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液4 ℃封閉過夜。與抗TGF-β1、Smad4、Smad7和GAPGH多克隆抗體于25 ℃孵育4 h，生物素標(biāo)記的Ⅱ抗孵育2 h。最后加入Western blot熒光檢測試劑激發(fā)熒光，于一體式化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描、分析各蛋白質(zhì)條帶的積分光密度。結(jié)果表示為與對(duì)照組的相對(duì)吸光度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間差異的顯著性分析采用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠肝臟指數(shù)及血清AST、ALT和HA含量檢測結(jié)果

如表1所示，與正常對(duì)照組比較，模型組的肝臟指數(shù)、AST、ALT和HA含量明顯增加；與模型組比較，白屈菜紅堿組的肝臟指數(shù)、AST、ALT和HA含量明顯降低(P<0.05)。

2 肝組織羥脯氨酸含量檢測結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組Hyp含量明顯增加；與模型組比較，白屈菜紅堿組的Hyp含量明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠肝臟指數(shù),血清AST、ALT和HA及肝組織Hyp含量的測定

*P<0.05vsmodel group.

3 肝組織HE和VG染色

HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常;模型組小鼠肝細(xì)胞不同程度的水腫、脂肪樣病變及炎癥細(xì)胞浸潤，并可見明顯的纖維隔形成；白屈菜紅堿各劑量組，隨白屈菜紅堿給藥劑量增加，小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)損傷隨之改善，肝細(xì)胞的水腫程度、脂肪樣病變及炎癥細(xì)胞浸潤程度明顯減少，白屈菜紅堿高劑量組未見纖維隔形成，見圖1。

小鼠肝組織中纖維蛋白經(jīng)VG染色顯示為紅色。正常組小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)正常，匯管區(qū)及中央靜脈周圍幾乎無纖維增生；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，肝臟匯管區(qū)及周圍纖維結(jié)締組織增生明顯；白屈菜紅堿各劑量組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)損傷改善明顯，纖維沉積、匯管區(qū)或中央靜脈間纖維間隔較模型組小鼠明顯變薄,結(jié)締組織增生明顯減少，見圖1。

Figure 1. Liver tissues with hematoxylin-eosin (HE) staining and Van Gieson staining (×200).

圖1各組小鼠肝組織HE和VG染色

4 肝組織中TGF-β1、Smad3、Smad4和Smad7的mRNA表達(dá)

如表2所示，與正常對(duì)照組比較，模型組中TGF-β1、Smad3和Smad4的mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，Smad7的mRNA表達(dá)均明顯下調(diào);與模型組比較，白屈菜紅堿組TGF-β1、Smad3和Smad4的mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)，Smad7的mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。

5 肝組織中TGF-β1、Smad4 和Smad7蛋白表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中TGF-β1和Smad4的蛋白表達(dá)顯著增加，Smad7的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05);與模型組相比，白屈菜紅堿組小鼠肝組織中TGF-β1和Smad4的蛋白表達(dá)顯著降低，Smad7的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effect of chelerythrine on the protein expression of TGF-β1, Smad4 and Smad7 in the liver tissues. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmodel group.

圖2白屈菜紅堿對(duì)TGF-β1、Smad4和Smad7蛋白表達(dá)的影響

表2 各組小鼠肝臟TGF-β1、Smad3、Smad4和Smad7的mRNA表達(dá)

*P<0.05vsmodel group.

討 論

肝纖維化是機(jī)體對(duì)慢性肝損傷炎癥刺激的一種修復(fù)反應(yīng)。腹腔注射CCl4混合溶液誘導(dǎo)的肝纖維化損傷模型是最常用的肝纖維化模型[9]。CCl4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中逐漸代謝生成活潑的三氯甲基自由基和氯自由基，使肝細(xì)胞變性壞死，肝內(nèi)脂質(zhì)細(xì)胞膜發(fā)生溶解，細(xì)胞內(nèi)大量肝內(nèi)酶(AST和ALT等)滲出進(jìn)入血液，其滲出含量在一定程度上反映肝臟受損程度，而長期的CCl4刺激可誘發(fā)纖維化損傷。

AST和ALT是肝細(xì)胞漿內(nèi)比較多的活性酶，是評(píng)價(jià)肝功能的主要指標(biāo)[10]，肝細(xì)胞膜輕度損傷就可使血液中的AST和ALT含量顯著升高。HA是細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖的主要成分，可維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，在肝纖維化發(fā)生時(shí)血中HA含量即顯著升高。檢測血清HA，可反映肝纖維化的程度。肝臟纖維化時(shí)可見大量的膠原蛋白生成和沉積，Hyp是膠原蛋白特有的氨基酸，其含量變化可反映出細(xì)胞合成和分泌膠原蛋白的功能，客觀地反映肝纖維化程度[11]。因此本研究選擇以檢測AST、ALT、HA和Hyp含量觀察CCl4溶液對(duì)小鼠肝纖維化損傷程度。

本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝臟指數(shù),血清中AST、ALT和HA水平及肝組織Hyp含量較正常對(duì)照組均顯著增加，病理學(xué)檢測鏡下觀察到肝內(nèi)纖維組織增生明顯，說明模型組小鼠肝損傷嚴(yán)重，本研究利用CCl4混合溶液誘導(dǎo)的肝纖維化損傷模型復(fù)制成功。而灌胃不同劑量的白屈菜紅堿后，小鼠肝臟指數(shù)，血清中AST、ALT和HA水平及肝組織Hyp含量較模型組均顯著降低，病理學(xué)檢測可觀察到肝內(nèi)增生的纖維組織改善明顯，說明白屈菜紅堿對(duì)利用CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化損傷具有保護(hù)作用。

肝纖維化是一個(gè)復(fù)雜的過程，TGF-β/Smads信號(hào)通路是肝纖維化主要的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在其發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[12]。TGF-β是目前被認(rèn)為最強(qiáng)的致纖維化的因子之一，它可以影響ECM的生成，促進(jìn)膠原蛋白合成，通過抑制基質(zhì)降解酶的活性而抑制ECM正常的降解，導(dǎo)致ECM過度沉積[13]。Smads蛋白是目前所知的唯一TGF-β受體的胞內(nèi)激酶底物，是TGF-β跨細(xì)胞膜傳入細(xì)胞核的關(guān)鍵蛋白[14-15]。

肝纖維化發(fā)生時(shí)，TGF-β作為配體與受體形成的復(fù)合物磷酸化，激活Smad2和Smad3，再與胞漿內(nèi)的Smad4形成復(fù)合物由胞漿傳導(dǎo)至胞核內(nèi)，從而與特定DNA序列結(jié)合，調(diào)控特異性靶基因特別是ECM等目的基因的轉(zhuǎn)錄并高表達(dá)，形成HF[16-18]。Smad7是TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，它可以抑制Smad2/3介導(dǎo)的基因表達(dá)，與Smad4競爭性地結(jié)合磷酸化的受體，形成無活性的復(fù)合物，阻礙TGF-β信號(hào)向下游傳導(dǎo)，從而抑制ECM的沉積[19-20]。因此，Smads家族蛋白是TGF-β信號(hào)傳遞的關(guān)鍵性蛋白，是TGF-β介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的重要節(jié)點(diǎn)，Smad3、Smad4和Smad7為其關(guān)鍵信號(hào)分子，通過調(diào)控Smad 3、Smad4和Smad7蛋白可以阻斷TGF-β信號(hào)的繼續(xù)傳導(dǎo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同劑量白屈菜紅堿可顯著影響TGF-β1、Smad3和Smad4的mRNA以及負(fù)調(diào)節(jié)因子Smad7的mRNA的表達(dá)，提示白屈菜紅堿對(duì)TGF-β受體復(fù)合物由胞漿傳導(dǎo)至胞核的信號(hào)傳導(dǎo)有阻斷作用。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白屈菜紅堿對(duì)TGF-β1、Smad4以及Smad7蛋白表達(dá)的干預(yù)作用，進(jìn)一步驗(yàn)證白屈菜紅堿對(duì)小鼠肝纖維化有一定的抑制作用，且與TGF-β/Smads信號(hào)通路有關(guān)。