趙良淵， 侯曉敏, 秦小江

(山西醫(yī)科大學(xué) 1體育教學(xué)部， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 3公共衛(wèi)生學(xué)院， 山西 太原 030001)

血管舒張功能減弱是高血壓的發(fā)病原因之一[1]。在血管壁的結(jié)構(gòu)中，主要調(diào)控血管舒縮活動(dòng)的是血管中膜，而血管中膜主要由血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)組成。VSMCs收縮可減小血管直徑，進(jìn)而引起血壓的升高，反之VSMCs舒張則可降低血壓[2]。α1-腎上腺素能受體(α1-adrenergic receptor,α1-AR)主要包括α1A、α1B和α1D3種亞型[3]，其中α1A和α1D對(duì)血壓的調(diào)節(jié)非常重要，且有研究表明α1D亞型參與VSMCs的收縮與舒張相關(guān)信號(hào)調(diào)控過(guò)程[4-5]，而胞內(nèi)Ca2+濃度及鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)水平與VSMCs的收縮活動(dòng)密切相關(guān)[4-7]。本課題組此前對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)和正常對(duì)照大鼠(Wistar-Kyoto RAT，WKY大鼠)的主動(dòng)脈組織進(jìn)行全基因表達(dá)譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與WKY大鼠相比，SHR的Adra1d基因(α1D-AR的基因)表達(dá)量顯著升高[8]。因此我們推測(cè)，Adra1d基因可通過(guò)調(diào)控Ca2+濃度及CaM的表達(dá)對(duì)VSMCs的舒縮活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

針對(duì)Adra1d基因的mRNA編碼區(qū)設(shè)計(jì)同源shRNA，把shRNA與載體質(zhì)粒GV248結(jié)合為重組質(zhì)粒并導(dǎo)入慢病毒內(nèi)。慢病毒侵染大鼠主動(dòng)脈VSMCs后，病毒攜帶的shRNA被導(dǎo)入大鼠主動(dòng)脈VSMCs中并與之基因組相結(jié)合，從而導(dǎo)致Adra1d基因表達(dá)沉默，且shRNA可以在細(xì)胞中被穩(wěn)定表達(dá)[9]，可保證3代以上細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)Adra1d基因設(shè)計(jì)進(jìn)行RNA干擾(RNA interference, RNAi)實(shí)驗(yàn)，建立shRNA慢病毒表達(dá)載體，探討Adra1d基因與大鼠主動(dòng)脈VSMCs內(nèi)Ca2+濃度和CaM變化的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

雄性SD大鼠，150～180 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(晉)2009-0001。HEK293細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞庫(kù))。

慢病毒載體GV248(吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；Lipofectamine 2000(Thermo Scientific)；兔抗鼠 Adra1d多克隆抗體(Abcam)。

2 方法

2.1原代VSMCs的培養(yǎng)及鑒定 大鼠麻醉后，快速取其胸主動(dòng)脈，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMCs。選取第4～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用免疫組化染色法對(duì)VSMCs進(jìn)行鑒定，I 抗為抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體，胞質(zhì)著棕色的細(xì)胞為VSMCs。

2.2Adra1dshRNA慢病毒載體的構(gòu)建和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選 根據(jù)分析結(jié)果，設(shè)計(jì)得到4條shRNA靶點(diǎn)序列。另外，選擇scrambled序列[10]作為RNAi陰性轉(zhuǎn)染組。設(shè)計(jì)得到的shRNA1序列為5’-GCTCAAGTACCCAGCCATTAT-3’，shRNA2序列為5’-GCCAAAGGATATCCCGGAACA-3’，shRNA3序列為5’-GCTGTCATCTGCCAGGCTTAT-3’，shRNA4序列為5’-AAACTACTTAGTCAACTCCTA-3’，scramble序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

根據(jù)以上shRNA靶點(diǎn)序列，分別設(shè)計(jì)合成正、反2條單鏈寡核苷酸。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，擴(kuò)增得到shRNA-Adr載體。寡核苷酸序列見(jiàn)表1。

表1 合成的shRNA寡核苷酸序列

對(duì)載體進(jìn)行酶切、退火、連接、轉(zhuǎn)化、菌落鑒定等操作[11-12]。5種質(zhì)粒分別命名為shRNA1-Adr、shRNA2-Adr、shRNA3-Adr、shRNA4-Adr和scrambled。

用RT-qPCR篩選干擾效果。分別用shRNA1-Adr、shRNA2-Adr、shRNA3-Adr、shRNA4-Adr、scrambled載體與表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，測(cè)定Adra1d mRNA的表達(dá)水平。Adra1d的正向引物序列為5’-TCAAGCCTACT CAACTGCTGG-3’，反向引物序列為5’-TGTTACAACGAAAGGCAGACTG-3’；β-actin的正向引物序列為5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’，反向引物序列為5’-CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3’。

選定合適的shRNA載體，將其與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。5種病毒分別命名為L(zhǎng)v-shRNA1-Adr、Lv-shRNA2-Adr、Lv-shRNA3-Adr、Lv-shRNA4-Adr和Lv-scrambled。對(duì)慢病毒進(jìn)行濃縮純化，測(cè)定滴度和感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)。用含8 mg/L轉(zhuǎn)染增強(qiáng)液的培養(yǎng)液對(duì)慢病毒原液稀釋?zhuān)蛊銶OI值分別為15、30、45、60和75。用不同MOI值的稀釋液培養(yǎng)VSMCs。

將VSMCs接種入96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜。24 h后，細(xì)胞匯合度達(dá)30%～40%可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。向VSMCs加入最適MOI值的稀釋后培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染12 h后換液。3 d后，更換為含1 μg/L嘌呤霉素的篩選培養(yǎng)基。20 d后，向VSMCs中加入含0.5 μg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)液。凍存同一批次的細(xì)胞20支備用。

2.3RT-qPCR檢測(cè)Adra1d和CaM的mRNA表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的VSMCs測(cè)定Adra1d mRNA的相對(duì)表達(dá)量。分別收集正常和轉(zhuǎn)染的VSMCs測(cè)定CaM mRNA相對(duì)表達(dá)量。以β-actin為內(nèi)參照。冰上收集細(xì)胞并裂解，提取總RNA。CaM的正向引物序列為3’-ACTCCACCTACGACTACC-5’，反向引物序列為 5’-TGAGGTGGATGCTGATGG- 3’。依據(jù)說(shuō)明加入反轉(zhuǎn)錄體系，室溫放置10 min，之后42 ℃和95 ℃下分別15 min和5 min，反轉(zhuǎn)錄之后得cDNA模板。將模板加入擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為： 95 ℃ 45 s， 60 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min，連續(xù)循環(huán)30次；最后在72 ℃條件下持續(xù)5 min。計(jì)算CaM mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.4Western blot檢測(cè)Adra1d和CaM蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的VSMCs測(cè)定Adra1d的蛋白表達(dá)量。分別收集正常的和轉(zhuǎn)染后的VSMCs測(cè)定CaM的蛋白表達(dá)量。以β-actin為內(nèi)參照。冰上收集細(xì)胞并裂解，提取蛋白質(zhì)。取40 μg蛋白質(zhì)經(jīng)凝膠電泳分離，恒壓電轉(zhuǎn)到NC膜上，脫脂牛奶封閉 3 h， TBST 連續(xù)3次洗膜。將NC膜置于相應(yīng)的Ⅰ抗溶液中(CaM稀釋比例為1 ∶1 000，β-actin稀釋比例為1∶4 000)，4 ℃過(guò)夜。用TBST連續(xù)3次洗膜，然后將膜置于HRP標(biāo)記的Ⅱ抗(稀釋比例為1∶4 000)，室溫孵育2 h，連續(xù)3次洗膜。向NC膜滴加ECL(300 μL)顯色液，顯影檢測(cè)，掃描條帶，然后用ImageJ對(duì)各條帶的灰度值進(jìn)行計(jì)算。

2.5VSMCs內(nèi)鈣離子濃度的測(cè)定 Fluo-4/AM(3 μmol/L)標(biāo)記大鼠主動(dòng)脈VSMCs內(nèi)Ca2+，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)VSMCs內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的變化，以之間接反映VSMCs內(nèi)游離Ca2+濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 原代大鼠主動(dòng)脈VSMCs的培養(yǎng)及鑒定

大鼠胸主動(dòng)脈組織塊培養(yǎng)1周后出現(xiàn)VSMCs，12 d后VSMCs匯合，見(jiàn)圖1A；經(jīng)α-SMA免疫組化染色后，可見(jiàn)胞質(zhì)呈棕色，見(jiàn)圖1B。

Figure 1. Primary culture and identification of rat aortic VSMCs (×100). A： primary culture of VSMCs; B: identification of VSMCs by immunocytochemical staining of α-SMA.

圖1大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

2 RT-qPCR篩選干擾效果

RT-qPCR結(jié)果顯示，與scrambled組相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNA4組中Adra1d的mRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，且shRNA4組的Adra1d mRNA表達(dá)量最低，見(jiàn)圖 2。因此，我們選擇shRNA4序列構(gòu)建載體，并包裝慢病毒。

Figure 2. The mRNA expression of Adra1d in 293T cells after transfection with 5 different shRNA plasmids. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled group.

圖25種不同的shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的Adra1dmRNA表達(dá)

3 慢病毒轉(zhuǎn)染后大鼠主動(dòng)脈VSMCs內(nèi)Adra1d的mRNA和蛋白表達(dá)

與scrambled組比較，轉(zhuǎn)染后VSMCs的Adra1d mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The expression of Adra1d at mRNA and protein levels in the VSMCs after Lv-shRNA4-Adr transfection. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsscrambled group.

圖3Lv-shRNA4-Adr轉(zhuǎn)染大鼠主動(dòng)脈VSMCs后Adra1d的mRNA和蛋白表達(dá)

4 大鼠主動(dòng)脈VSMCs內(nèi)Ca2+濃度的變化

Adra1d基因靶向沉默后，VSMCs的Ca2+熒光強(qiáng)度顯著高于scrambled組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 4. The changes of [Ca2+]iintensity in rat aortic VSMCs (×100). Mean±SD.n=6.**P<0.01vsscrambled group.

圖4大鼠主動(dòng)脈VSMCs內(nèi)Ca2+濃度的變化

5 慢病毒轉(zhuǎn)染后CaM表達(dá)量的變化

對(duì)比正常大鼠主動(dòng)脈VSMCs，Adra1d基因靶向沉默后， VSMCs中CaM的mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 5. The expression of CaM in the rat aortic VSMCs. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled group.

圖5大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞CaM的mRNA和蛋白表達(dá)

討 論

VSMCs通過(guò)調(diào)控多種收縮蛋白、離子通道和信號(hào)分子而調(diào)節(jié)血管的舒縮活動(dòng)。α1D-AR存在于細(xì)胞膜上，可調(diào)控收縮舒張信號(hào)通路。α1D-AR的升壓作用可能與它促進(jìn)細(xì)胞收縮有關(guān)[13]，在苯腎上腺素導(dǎo)致VSMCs收縮的過(guò)程中，VSMCs的收縮速度與α1-AR的各亞型分布有關(guān)[14]，α1-AR各亞型可能通過(guò)影響交感神經(jīng)調(diào)節(jié)血壓的頻率和振幅從而調(diào)節(jié)血壓。相關(guān)研究表明，在兒茶酚胺所引起的升壓作用中，約有70%的作用是由α1D-AR引起的[14]，α1D-AR在大動(dòng)脈收縮過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15]。α1D-AR不僅可以直接調(diào)控血管收縮[16]，還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其它亞型α1-AR的表達(dá)量從而發(fā)揮作用[17]?？梢?jiàn)，Adra1d基因與血壓升高過(guò)程密切相關(guān)，該基因?qū)Ω哐獕河袧撛诘闹委熥饔?，因此，?gòu)建Adra1d基因的shRNA慢病毒載體有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Adra1d基因shRNA可增加大鼠主動(dòng)脈VSMCs內(nèi)Ca2+濃度，Adra1d基因被靶向沉默后，大鼠主動(dòng)脈VSMCs的Ca2+熒光強(qiáng)度顯著高于scrambled組。而且與scrambled組相比較，轉(zhuǎn)染Adra1d基因shRNA的大鼠主動(dòng)脈VSMCs中的CaM mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著增加,而Ca2+和CaM作為細(xì)胞收縮過(guò)程中的關(guān)鍵因子和蛋白，其濃度增加之后，均可引發(fā)VSMCs發(fā)生收縮。

Sun等[6]針對(duì)Adra1d基因設(shè)計(jì)合成了siRNA，將siRNA導(dǎo)入大鼠VSMCs中，發(fā)現(xiàn)Adra1d基因的蛋白表達(dá)量顯著下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Adra1d基因shRNA可顯著降低大鼠VSMCs內(nèi)Adra1d的mRNA和蛋白表達(dá)量?；贏dra1d基因與血壓升高過(guò)程密切相關(guān)，所以本次研究結(jié)果將對(duì)指導(dǎo)臨床高血壓的治療，尋找新的治療靶點(diǎn)有重要意義。