李秀英， 張衛(wèi)東， 江 剛

(湖南省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 湖南 長沙 410006)

煙霧暴露對呼吸道免疫功能、肺部結(jié)構(gòu)和肺功能均產(chǎn)生影響，引起多種呼吸系統(tǒng)疾病。而氣道上皮是肺部抵御外界理化因素刺激的第一道防線。病原微生物及外界有害的微塵顆粒和氣體等因素導(dǎo)致的氣道上皮損傷是慢性肺部疾病的起始環(huán)節(jié)和病理基礎(chǔ)。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-rela-ted factor 2,Nrf2)是近年新發(fā)現(xiàn)的機體抵抗內(nèi)外界氧化和化學(xué)等刺激的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[1]。我們的前期研究認為,Nrf2在慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病過程中有抗炎和抗氧化的作用，而IκB激酶家族(IκB kinases,IKKs)/核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)信號途徑廣泛參與了多種炎性疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在氣道疾病中亦有關(guān)鍵作用[2-3]。在多數(shù)情況下，NF-κB的激活需要依靠IKKs的激活。為進一步明確Nrf2在煙草提取物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細胞中與IKKs的關(guān)系，本實驗以支氣管上皮細胞為研究目標，予以香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract,CSE)刺激，使其產(chǎn)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，同時采用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制Nrf2的表達或采用15-脫氧前列腺素J2(15-deoxy-prostaglandin J2,15d-PGJ2)預(yù)處理增加Nrf2的表達，觀察IKKs在氣道上皮細胞的表達。

材 料 和 方 法

1 主要材料

正常人支氣管上皮(normal human bronchial epithelial，NHBE)細胞株購于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細胞中心；胎牛血清和兔抗鼠NF-κB p65抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；抗Nrf2和IKKα/β抗體及抗β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz；15d-PGJ2購自Merck；Nrf2 siRNA及陰性對照siRNA(negative control siRNA,NC-siRNA)由上海吉瑪生物合成；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000試劑、Taq DNA聚合酶混合物和RT-PCR試劑盒購自Invitrogen；MTT試劑盒購自南京凱基生物；ECL檢測試劑盒購自Sigma。CSE參考江剛等[4]的制作方法。

2 方法

2.1人支氣管上皮細胞的培養(yǎng) 取正常人支氣管上皮細胞株解凍復(fù)蘇后加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，制成細胞懸液，分種于培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，每隔2～3 d 換培養(yǎng)液 1 次，待細胞生長達80%融合時，用0.125%胰酶和0.02% EDTA消化細胞，相差顯微鏡下見細胞收縮，細胞間隙清晰，立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使細胞離開消化液，棄去消化液，之后加入10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，按2×105的密度將細胞接種于6 孔板中，使細胞生長再次達到70%融合用于實驗。根據(jù)細胞毒性MTT方法檢測結(jié)果，確定CSE處理NHBE細胞濃度為5%，作用時間為24 h，無明顯細胞毒作用且不同時段細胞存活率有下降趨勢，可以適用于后續(xù)實驗。

2.2siRNA干擾實驗 轉(zhuǎn)染前 1 d，取(4～5)×104個細胞接種在6孔板上，用2 mL含F(xiàn)BS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在24 h 內(nèi)使細胞匯合達到70%。使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染siRNA。37 ℃、CO2培養(yǎng)箱孵育24～72 h，直到適合分析(6 h取出 FAM熒光標記的對照siRNA轉(zhuǎn)染孔，放置熒光鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，保證轉(zhuǎn)染效率達到70%以上)。找出干預(yù)效果最好的一個siRNA片段，另加一個轉(zhuǎn)染效率檢測組(FAM熒光標記的對照siRNA)，轉(zhuǎn)染時保證轉(zhuǎn)染率達到70%以上。RT-PCR鑒定確認RNA干預(yù)的效果，根據(jù)RT-PCR檢測結(jié)果，確定siRNA沉默效果最好的基因序列：sense：5’-AGAUUUAGAUCAUUUGAAATT-3’；anti-sense：5’-UUUCAAAUGAUCUAAAUCUTG-3’。

2.3細胞分組 本實驗設(shè)正常對照(control)組、 CSE刺激(CSE)組、15d-PGJ2預(yù)處理后CSE刺激(15d-PGJ2+CSE)組和Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染后CSE刺激(Nrf2 siRNA+CSE)組，每組5個復(fù)孔。15d-PGJ2干預(yù)的濃度為10 μmol/L，作用30 min[3]。

2.4RT-PCR法檢測mRNA的表達 用TRIzol試劑一步法提取組織RNA，按照3步逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(MBI)說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以獲得的cDNA為模板，采用一步法進行PCR擴增。引物序列見表1，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用Labworks 4．5分析軟件對PCR產(chǎn)物進行分析。

表1 目的基因的引物序列

F: forward; R: reverse.

2.5Western blot 法檢測蛋白表達 參考分子克隆指南，提取總蛋白，測定總蛋白含量，取50 μg樣品進行SDS-PAGE，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶500的兔抗Nrf2和IKKα/β抗體，37 ℃溫育2 h后，棄去 I 抗，加入羊抗兔的 II 抗，37 ℃溫育 1 h，根據(jù)ECL檢測試劑盒檢測特異性蛋白條帶。蛋白的相對表達為目的基因灰度值/內(nèi)參照(GAPDH)灰度值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 支氣管上皮細胞中各因子mRNA的表達

CSE干預(yù)支氣管上皮細胞后，Nrf2和IKKα/β的mRNA表達水平均明顯升高(P<0.05)；采用15d-PGJ2預(yù)處理后，Nrf2的mRNA較CSE單用刺激組表達明顯升高，而IKKα/β的mRNA較CSE單用刺激組表達明顯降低(P<0.05);而進行Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染的支氣管上皮細胞中Nrf2的mRNA被抑制，IKKα/β的mRNA較CSE單用刺激組表達卻明顯升高(P<0.05)，見圖1、表2。

Figure 1. The images of agarose gel electrophoresis for analyzing the mRNA expression of Nrf2, IKKα and IKKβ in the NHBE cells. M: DL2000 DNA marker; L1: control group; L2: CSE group; L3: 15d-PGJ2+CSE group; L4:Nrf2 siRNA+CSE group.

圖1瓊脂糖凝膠電泳分析Nrf2、IKKα和IKKβ的mRNA表達

表2支氣管上皮細胞中各目標基因的mRNA表達

Table 2. The mRNA expression of target genes in NHBE cells (Mean±SD.n=5)

GroupNrf2IKKαIKKβControl0．51±0．030．46±0．010．49±0．01 CSE0．60±0．01?0．70±0．02?0．72±0．01? 15d?PGJ2+CSE0．87±0．02#0．59±0．01#0．58±0．01# Nrf2siRNA+CSE0．17±0．03#0．81±0．01#0．88±0．02#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

2 Western blot檢測各組細胞中Nrf2和IKKα/β的表達

CSE刺激支氣管上皮細胞后，Nrf2，IKKα/β的蛋白表達均明顯升高(P<0.05)，采用15d-PGJ2預(yù)處理后，Nrf2的水平較CSE單用刺激組表達明顯升高，而IKKα/β的水平較CSE單用刺激組表達明顯降低(P<0.05)；而進行Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染的支氣管上皮細胞中Nrf2的蛋白表達被抑制，IKKα/β的蛋白水平較CSE單用刺激組表達卻明顯升高(P<0.05)，見圖2、表3。

討 論

IKK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是NF-κB信號通路中的關(guān)鍵成員。經(jīng)典IKK家族成員包括有IKKα和IKKβ，在大多數(shù)細胞中均有表達。

Figure 2. The protein expression of Nrf2, IKKα and IKKβ in the NHBE cells.

圖2NHBE細胞中各目標基因的蛋白表達情況

表3細胞中各目標基因的蛋白表達情況

Table 3. The protein expression of target genes in NHBE cells (Mean±SD.n=5)

GroupNrf2IKKαIKKβControl0．17±0．000．19±0．010．22±0．01 CSE0．29±0．01?0．36±0．01?0．38±0．02? 15d?PGJ2+CSE0．46±0．02#0．25±0．01#0．26±0．01# Nrf2siRNA+CSE0．17±0．00#0．43±0．02#0．46±0．01#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

靜息狀態(tài)下，NF-κB位于胞質(zhì)中，與IκB結(jié)合，以復(fù)合體的形式存在，此時活性被IκB所抑制。而一旦IKK被激活，即可誘發(fā)IκB的磷酸化而降解失活。NF-κB失去IκB抑制而活化，從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，與靶基因位點結(jié)合，迅速誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，啟動一系列炎癥目標因子的轉(zhuǎn)錄[5-6]。

吸煙是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)和肺癌的重要病因，香煙煙霧是呼吸道最常見的外界應(yīng)激因子。本實驗以人支氣管上皮細胞株為研究對象，采用CSE刺激支氣管上皮細胞，使其處于氧化應(yīng)激的損害中，氧化應(yīng)激反應(yīng)中關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達增加;而15d-PGJ2能進一步促進Nrf2的激活，使其表達水平上升;使用siRNA技術(shù)抑制了Nrf2，觀察炎癥轉(zhuǎn)錄因子激活酶IKKα/β的表達改變。結(jié)果顯示在CSE的刺激下，IKKα/β的mRNA及蛋白水平均有明顯的增高，說明CSE刺激可激活支氣管上皮細胞內(nèi)的IKKα/β。而在Nrf2的誘導(dǎo)劑15d-PGJ2靜脈注射干預(yù)后，Nrf2的表達進一步增加，IKKα/β的mRNA及蛋白水平均較單一CSE刺激組明顯的降低；在Nrf2 siRNA干預(yù)后，Nrf2的表達得到明顯抑制,再予以香煙煙霧提取物刺激，發(fā)現(xiàn)IKKα/β的水平均較單一CSE刺激的正常支氣管上皮細胞明顯升高。因此，香煙煙霧誘導(dǎo)支氣管上皮細胞被氧化應(yīng)激激活后，核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達改變了炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB上游IκB的激酶IKKs的表達，Nrf2高水平表達能抑制IKKs在人支氣管上皮細胞中的表達。

COPD和肺癌是呼吸道的常見疾病，發(fā)病率高，社會經(jīng)濟負擔(dān)重。而吸煙是它的重要發(fā)病因素，也是活性氧化物的主要來源，隨著社會工業(yè)化程度的快速發(fā)展，大氣污染也是一個不可忽視的活性氧化物來源，這2種疾病的發(fā)生率和死亡率持續(xù)上升，因此，找到準確的治療靶點已經(jīng)迫在眉睫。而Nrf2和IKKs廣泛參與了急慢性炎性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-10]，因此進一步明確Nrf2和IKKs之間的調(diào)控機制有廣闊的應(yīng)用前景。