王文香， 張妞妞， 曾先燕， 李廷瑞， 吉曄楠， 賀忠梅△

(1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系， 細(xì)胞生理學(xué)山西省重點實驗室， 山西 太原 030001； 2蘇州大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)部， 江蘇 蘇州 215123)

缺血性心臟病是臨床上致死率和致殘率極高的疾病。隨著介入和溶栓等再灌注療法的實施，患者的急性期死亡率明顯降低[1]，但由再灌注所致的心肌梗死、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及炎癥等額外的損傷也不容忽視[2]。低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在常氧時，HIF-1α在脯氨酸羥化酶(proline hydroxylase，PHD)的作用下被蛋白酶體降解；而在低氧時，PHD的活性被抑制而使HIF-1α不能被降解，與β亞單位形成復(fù)合體而調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此研究者多采用PHD抑制劑二甲基乙二酰甘氨酸(dimethyloxalyl glycine，DMOG)來穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)，從而研究HIF-1α對心臟的保護(hù)作用[3]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以減輕缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡和心肌梗死面積，從而保護(hù)心功能[4]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細(xì)胞及果蠅的炎癥損傷中，HIF-1α可以減輕核因子κB(nuclear factor-κB)及炎癥因子的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)[5-6]。但是，在大鼠心肌缺血再灌注模型中，HIF-1α是否也可以減輕由再灌注引起的炎性損傷缺乏相關(guān)的報道。因此，本實驗旨在探討HIF-1α在大鼠心肌缺血再灌注引起的炎性損傷中的作用及其可能的機(jī)制，并為臨床抑制缺血性疾病的炎癥反應(yīng)提供一個新的策略。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

選取健康雄性Wistar清潔級SPF大鼠60只，8周齡，體重230～250 g，由山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供[購自中國食品藥品檢定研究院，許可證號：SCXK(京)2014-0013]。將大鼠分籠飼養(yǎng)于清潔的籠具中，室溫25 ℃，自由進(jìn)食和飲水，相對濕度60%。 DMOG購自Sigma-Aldrich； Lificiguat (YC-1)購自Cayman；抗HIF-1α抗體購于Cell Signaling Technology；抗Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和NF-κB抗體購自Proteintech；real-time PCR試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；DNA合成試劑盒購于Invitrogen；髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)測試盒購于南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1實驗分組 60只大鼠隨機(jī)分為4組(n=15)：(1)假手術(shù)(sham)組，心臟冠狀動脈左前降支只穿線不結(jié)扎；(2)I/R組，心肌缺血45 min再灌注3 h，生理鹽水干預(yù)；(3)HIF-1α穩(wěn)定劑DMOG+I/R組，術(shù)前24 h腹腔注射DMOG(40 mg/kg)；(4)HIF-1α抑制劑YC-1+I/R組，術(shù)前30 min股靜脈注射YC-1(2 mg/kg)。

2.2大鼠心肌缺血再灌注模型的建立 大鼠稱重，麻醉，固定于手術(shù)臺，連接心電圖，頸部行氣管插管。左側(cè)開胸暴露心臟，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，心電圖ST段弓背抬高≥0.15 mV即表示心肌缺血成功。45 min后松開結(jié)扎線ST段逐漸回落再灌注3 h后處死動物并留取左心室前壁組織。

2.3Western blot檢測心肌組織HIF-1α、TLR4和NF-κB的蛋白表達(dá) 提取總蛋白，BCA法定量，上樣量100 μg進(jìn)行SDS-PAGE。采用半干轉(zhuǎn)膜，封閉0.5 h，I 抗?jié)舛葹?∶200, 4 ℃孵育過夜，II 抗(1∶500)孵育1 h，化學(xué)發(fā)光。采用ImageJ軟件分析條帶的灰度值。目的蛋白灰度值與GAPDH灰度值的比值表示蛋白的相對表達(dá)量。

2.4HE染色 心肌組織石蠟切片，二甲苯液脫蠟，梯度乙醇脫水各5秒，后水洗；蘇木素染色：滴加蘇木素，染色5～10 min，自來水沖洗多余的染液；鹽酸乙醇酸化：將切片在鹽酸乙醇缸內(nèi)快速蘸一下，立即入自來水中返藍(lán)，換一遍自來水后繼續(xù)返藍(lán)1 min；伊紅溶液染色3～5 min后，自來水洗去多余染液，梯度乙醇脫水、透明各5 s；封片：切片晾干，中性樹膠封固，蓋玻片封片，過夜干燥；在光學(xué)顯微鏡觀察圖像拍片。

2.5心肌組織MPO活性的檢測 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作：(1)稱取組織重量，準(zhǔn)備試劑，組織與試劑2按體積比1∶9制備成5%的組織勻漿；(2)取5%的組織勻漿0.9 mL加3號試劑0.1 mL，充分混勻后37 ℃水浴15 min，取出后待測。在460 nm處測各管吸光度(A)。計算公式：MPO活力(U/g tissue)=(測定A值-對照A值)/11.3×取樣量(g)。

2.6Real-time PCR法檢測心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4和NF-κB的mRNA表達(dá) 按TRIzol說明書提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后用實時定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件為:94 ℃預(yù)變性2 min; 94 ℃變性15 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。TLR4的上游引物序列為5’-TCACAACTTCAGTGGCTGGAT-3’，下游引物序列為5’-TGTCAGTACCAAGGTTGAGAGC-3’；NF-κB的上游引物序列為5’-GACTATGACTTGAATGCGGTCC-3’，下游引物序列為5’-TCAGCACCCAAAGTCACCAAGT-3’；IL-1β的上游引物序列為5’-TTGGGCTGTCCA-GATGAGAG-3’，下游引物序列為5’-CACACTAGCAGGTCGTCATCAT-3’；IL-6的上游引物序列為5’-GTATGAACAGCGATGATGCACT-3’，下游引物序列為5’-AACTCCAGAAGACCAGAGCAG-3’；TNF-α的上游引物序列為5’-GTGCCTCAGCCTCTTCTCATT-3’，下游引物序列為5’-CCAGTTGGTTGTCTTTGAGATCC-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CAGTATGACTCTACCCACGGC-3’，下游引物序列為5’-AGACTCCACGACATACTCAGC-3’。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DMOG預(yù)處理可以增加大鼠心肌組織中HIF-1α的蛋白水平

Western blot結(jié)果顯示，sham組有少量的HIF-1α蛋白表達(dá)，而I/R組HIF-1α的蛋白含量明顯增加(P<0.05)；而給予DMOG預(yù)處理后，HIF-1α的蛋白水平進(jìn)一步提高(P<0.05);運用HIF-1α抑制劑YC-1進(jìn)一步研究HIF-1α的作用，結(jié)果顯示，與I/R組相比，YC-1+I/R組HIF-1α的蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見圖1。這一結(jié)果提示大鼠在缺血再灌注后，提前給予DMOG可以穩(wěn)定HIF-1α的表達(dá)。

2 心肌組織HE染色結(jié)果

HE染色后細(xì)胞漿顯示為紅色，細(xì)胞核顯示為藍(lán)色。Sham組心肌纖維排列規(guī)整，未見炎性細(xì)胞浸潤；與sham組比較，I/R模型組大量炎性細(xì)胞浸潤，且伴有明顯細(xì)胞變性和壞死;與I/R組比較，DMOG干預(yù)后，可見少量炎性細(xì)胞浸潤，心肌排列相對整齊，病理改變輕微;而抑制HIF-1α后，心肌細(xì)胞腫脹壞死及炎性細(xì)胞浸潤更加明顯，見圖2。上述結(jié)果表明HIF-1α可減輕大鼠缺血再灌注心肌組織的炎性損傷。

Figure 1. The protein expression of HIF-1α in the myocardial tissues determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖1Westernblot檢測心肌組織HIF-1α的蛋白水平

Figure 2. The HE staining results of the myocardial tissues (×250).

圖2心肌組織的HE染色結(jié)果

3 HIF-1α可以降低I/R大鼠心肌組織MPO的活性

MPO被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞激活的標(biāo)志。如圖3所示，與sham組相比，I/R組的MPO活性顯著升高(P<0.05)；而提前給予DMOG可以顯著降低MPO的活性(P<0.05)；HIF-1α抑制后，MPO的活性又升高(P<0.01)。

4 HIF-1α對大鼠I/R所致心肌組織炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

用real-time PCR技術(shù)檢測大鼠心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平[7]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，大鼠缺血再灌注后心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)增加(P<0.05)； 提前給予DMOG后3種炎癥因子的mRNA表達(dá)下降(P<0.05)；抑制HIF-1α的表達(dá)之后，炎癥因子的mRNA水平又增加(P<0.05)，見圖4。這一結(jié)果說明穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1α可以減少大鼠心肌缺血再灌注所致的炎癥因子的表達(dá)。

Figure 3. The MPO activity in the myocardial tissues. Mean±SD.n=3．*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖3心肌組織的MPO活性檢測

Figure 4. The mRNA levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖4Real-timePCR檢測大鼠心肌組織IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平

5 HIF-1α對大鼠心肌缺血再灌注中TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，I/R組心肌TLR4和NF-κB蛋白水平較sham組顯著升高(P<0.05); 給予DMOG后，與I/R組相比，TLR4和NF-κB的蛋白水平均降低(P<0.05)，見圖5A、B。Real-time PCR 結(jié)果同樣顯示，與I/R組相比，DMOG+I/R組TLR4和NF-κB的mRNA水平顯著下降(P<0.05)，見圖5C、D。以上結(jié)果表明大鼠心肌缺血再灌注后，HIF-1α可以抑制TLR4和NF-κB的表達(dá)。

Figure 5. The protein (A, B) and mRNA (C, D) expression levels of myocardial TLR4 (A, C) and NF-κB (B, D) determined by Western blot and real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

圖5Westernblot和real-timePCR檢測心肌組織TLR4和NF-κB的表達(dá)水平

討 論

本實驗通過建立大鼠心肌缺血再灌注模型，研究DMOG預(yù)處理后的心肌炎癥變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α逆轉(zhuǎn)了大鼠心肌缺血再灌注引起的的MPO活性升高、炎性細(xì)胞浸潤和炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的增加，同時降低與炎癥相關(guān)的信號通路TLR4和NF-κB的表達(dá)。由此可見，HIF-1α可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)，且可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。

低氧與炎癥緊密相連，在低氧時HIF-1α可以使氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒膺^程而產(chǎn)生能量以維持細(xì)胞的生理。在HIF-1α缺乏的骨膜細(xì)胞中，由于能量不足而使骨膜細(xì)胞發(fā)生炎性損傷[8]。在關(guān)節(jié)炎及心肌局部缺血所致的炎性損傷中，用PHD的藥物抑制劑DMOG可以減輕炎癥反應(yīng)[9]。此外PHD的抑制劑DMOG還可以減輕由脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)[10]。有研究表明，使用DMOG可減輕缺血心肌的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞的凋亡，降低心肌的纖維化程度，改善心室重構(gòu)，且該保護(hù)作用依賴于HIF-1α的激活[11]。本實驗中采用HIF-1α抑制劑YC-1也證實了HIF-1α的抗炎作用。

TLR4是細(xì)胞內(nèi)信號通路TLR4/NF-κB的上游分子[12]，被認(rèn)為可以調(diào)控由心肌缺血再灌注引起的炎癥損傷。在缺血時，受損的心肌組織釋放的一系列損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)可激活TLR4[13]?；罨腡LR4進(jìn)一步激活其下游的炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，隨后一些前炎癥因子IL-1、IL-6及TNF-α釋放增加，心肌損傷加重[14]。而在大鼠的缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，外周血白細(xì)胞內(nèi)多腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose) polymerase-1，PARP-1]的活化與系統(tǒng)中增高的炎癥細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β相關(guān)，PARP-1抑制劑能夠降低血清中前炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[15]。還有研究表明，在缺血性疾病中，受損的細(xì)胞釋放的危險信號即所謂的DAMPs與模式識別受體相互作用可激活體內(nèi)的固有免疫系統(tǒng)。心肌缺血再灌注時，壞死的心肌細(xì)胞釋放的危險信號包括高遷移率族盒蛋白1和熱休克蛋白與其受體(TLR4)相結(jié)合，進(jìn)而引起下游的MyD88/NF-κB信號通路的級聯(lián)放大[16]。在非活動狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB以二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受刺激時，IκB從二聚體解離并降解，因此釋放的NF-κB被磷酸化為NF-κB p65而進(jìn)入細(xì)胞核[17]。本實驗證明了HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)與TLR4/NF-κB信號通路的抑制有一定的關(guān)系，但還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)DMOG的抗炎作用是通過HIF-1α來實現(xiàn)的。HIF-1α為核轉(zhuǎn)錄因子，用DMOG穩(wěn)定其表達(dá)可以更好地探究其對心臟的保護(hù)作用。本實驗以此為基礎(chǔ)，為臨床治療缺血性疾病的藥物研發(fā)提供一定的實驗依據(jù)。