劉清南， 戴志兵， 袁中華， 劉圓月， 譚桂煌， 徐桂娜， 賀 旭

(1益陽醫(yī)學高等?？茖W校， 2益陽市中心醫(yī)院超聲科， 湖南 益陽 413000； 3南華大學心血管病研究所， 動脈硬化學湖南省重點實驗室， 湖南 衡陽 421001)

心腦血管疾病是威脅人類健康非常重要的疾病之一，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要原因，關(guān)于其發(fā)生機制的研究目前主要有脂質(zhì)浸潤學說、損傷反應(yīng)學說和炎癥學說等。大部分研究表明，AS發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)是單核巨噬細胞和平滑肌細胞內(nèi)大量蓄積脂質(zhì)所致的泡沫細胞形成以及隨后動脈粥樣硬化斑塊的形成。

脂滴包被蛋白PAT(perilipin-adipophilin-TIP47)家族成員之一——脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose diffe-rentiation-related protein，adipophilin)是脂滴外周含量較高的一種不完全包被蛋白，是Jiang等[1]在1992年利用差別雜交篩選技術(shù)在脂肪細胞中首次分離得到的，在之后的研究中發(fā)現(xiàn)它與脂肪代謝有關(guān)。目前的研究發(fā)現(xiàn)，adipophilin可促進細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，加速AS的發(fā)生發(fā)展。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)為異二聚體蛋白，由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成，具有Ser/Thr激酶與磷脂酰肌醇激酶活性。Akt是一種Ser/Thr蛋白激酶，作為PI3K的底物，與蛋白激酶A(protein kinase A， PKA)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)在結(jié)構(gòu)上很相似，因此Akt又被稱為蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路調(diào)控細胞生長與存活及細胞間信息傳遞等眾多信號轉(zhuǎn)導。近年來關(guān)于PI3K/Akt在代謝及炎癥方面的研究不斷增多。在脂質(zhì)代謝方面，敲除PI3K亞基p110可明顯減小ApoE-/-和LDLR-/-小鼠粥樣斑塊面積；抑制PI3K/Akt信號通路可顯著降低小鼠血清游離脂肪酸、膽固醇及甘油三酯水平[2]；通過肝臟特異性敲除調(diào)節(jié)亞基p85也可得到上述類似的結(jié)果[3]。在調(diào)控炎癥方面，高表達adipophilin的細胞中炎癥因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)明顯增高[4]，抑制PI3K/Akt信號可減少脂多糖誘導的單核/巨噬細胞中TNF-α和IL-6的分泌[5-6]，而AS與炎癥密切相關(guān)。

本實驗研究adipophilin是否能通過PI3K/Akt通路促進細胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積，并探討這一過程是否與Akt蛋白的直接相互作用有關(guān)，為探討adipophilin促進細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積提供干預(yù)的分子靶點。

材 料 和 方 法

1 細胞

RAW264.7細胞與HEK293細胞購自上海細胞生物學研究所細胞庫。

2 主要試劑

RPMI-1640和DMEM高糖培養(yǎng)基購于GE Healthcare Life Sciences；氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)購于北京協(xié)生生物科技有限責任公司；胎牛血清、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購于Thermo Fisher Scientific；pCMV-Tag2B質(zhì)粒購于Stratagene；Lipofectamine 2000、Protein G beads和TRIzol購于Invitrogen； adipophilin的引物由生工生物工程(上海)公司合成；EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶及T7 DNA連接酶購于New England Biolabs；小劑量質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購于Omega；SYBR Premix Ex Taq PCR反應(yīng)試劑盒和DNA Ladder購于TaKaRa；蛋白質(zhì)分子量標準購于SMOBIO；PVDF膜購于Millipore；抗Akt和p-Akt抗體購于Cell Signaling Technology；抗adipophilin抗體購于Abcam；Flag抗體和油紅O染料購于Sigma；IgG購于Thermo Fisher Scientific；Amersham ECL Prime化學發(fā)光底物購于GE Healthcare Life Sciences；DH5α感受態(tài)細胞和抗β-actin抗體購于生工生物工程(上海)公司；LY294002購于MedChem Express；其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

3 主要儀器

qPCR儀(Bio-Rad)；凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)；4 ℃離心機、酶標儀和液氮罐(Thermo Fisher Scientific)；離心機(Eppendorf)；超凈工作臺(Heal Force)；Milli-Q純水儀(Millipore)；LRH生化培養(yǎng)箱和恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科技有限公司)。

4 主要方法

4.1細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞和HEK293細胞分別置于含10% 胎牛血清的RPMI-1640和DMEM高糖培養(yǎng)基中，在溫度為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁達90%時傳代。

4.2實驗分組 實驗分為：control組(50 mg/L oxLDL處理RAW264.7細胞0 h)、BSA組(10% BSA處理RAW264.7細胞24 h)、12 h組(50 mg/L oxLDL處理RAW264.7細胞12 h)、24 h組(50 mg/L oxLDL處理RAW264.7細胞24 h)、24 h+LY組(終濃度為20 μmol/L的LY294002預(yù)處理RAW264.7細胞1 h，再用50 mg/L oxLDL處理24 h)和pCMV-Tag2B-adipophilin組(pCMV-Tag2B-adipophilin轉(zhuǎn)染HEK293細胞48 h)。

4.3載體構(gòu)建 TRIzol法提取HEK293細胞總的mRNA，逆轉(zhuǎn)為cDNA，用帶有酶切位點的引物(adipophilin的上游引物為5’-GCATCCGTTGCAGTT-3’，下游引物為5’-CAGGTTTAATGAGTTT-3’)以cDNA為模板進行PCR擴增，獲得adipophilin目的片段，將擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳后行膠回收，用EcoRⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶將膠回收產(chǎn)物和pCMV-tag2B載體于37 ℃酶切4 h，再行瓊脂糖凝膠電泳、膠回收，T7 DNA連接酶將載體和目的片段于16 ℃培養(yǎng)箱連接過夜，轉(zhuǎn)化、擴大培養(yǎng)、酶切、測序鑒定。

4.4Western blot實驗 裂解液裂解處理后的細胞，提取總蛋白。用BCA試劑盒定量后，干熱儀100 ℃加熱5 min使蛋白變性，加入SDS Loading Buffer混勻，經(jīng)SDS-PAGE(120 V電泳約1.5 h)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBST洗膜后分別用抗Akt、p-Akt、adipophilin和β-actin抗體于4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，每次15 min，再用辣根過氧化物酶標記的 II 抗室溫孵育1 h，ECL試劑曝光。蛋白條帶采用ImageJ軟件進行灰度定量，采用內(nèi)參照β-actin對目的蛋白的灰度值進行校正。

4.5qPCR 細胞按分組處理后，提取mRNA進行凝膠電泳，并逆轉(zhuǎn)為cDNA。Adipophilin的上游引物為5’-CTGTCTACCAAGCTCTGCTC-3’，下游引物為5’-CGATGCTTCTCTTCCACTCC-3’；GAPDH的上游引物為5’-TGCACCACCAACTGCTTA-3’，下游引物為5’-GGATGCAGGGATGATGTT-3’。參照SYBR Premix Ex Taq說明書進行操作。反應(yīng)體系為10 μL：SYBR mixture 5 μL，上、下游引物分別0.5 μL，cDNA 模板1 μL，水3 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性10 s， 58 ℃退火30 s， 35個循環(huán)。每個樣本重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt方法分析結(jié)果。

4.6油紅O染色 將RAW264.7細胞計數(shù)，吸入置有玻片的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細胞融合度達到90%時進行處理，之后取出玻片，用PBS溶液輕洗3次，50%異丙醇固定1 min，油紅O染液染色20 min后再用蘇木素染5 min，1%鹽酸乙醇分色；封片、觀察、拍照保存；細胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色。

4.7免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，CoIP) 轉(zhuǎn)染pCMV-Tag2B-adipophilin入HEK293細胞，48 h后收集細胞，用裂解液[150 mmol/L NaCl, 1% NP-40，50 mmol/L Tris (pH 7.5)，2 mmol/L EDTA，0.1% SDS，蛋白酶抑制劑]裂解細胞提取蛋白，加入Protein G beads 10 μL預(yù)孵育1 h，放置于磁力架上5 min，吸取上清，加入IgG和Flag抗體于4 ℃搖床過夜，再加入20 μL Protein G beads于4 ℃孵育3～4 h，用PBS洗3次后再用細胞裂解液洗2次，加入1×SDS Loa-ding Buffer 20 μL于100 ℃煮5 min，行Western blot檢測免疫共沉淀效果。

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferronit檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 oxLDL處理RAW264.7細胞后，adipophilin和p-Akt的水平增加，脂質(zhì)蓄積增多

細胞培養(yǎng)36 h后，待細胞約長滿達90%以上，加入50 mg/L oxLDL處理細胞0 h、12 h和24 h，提取各組細胞蛋白和mRNA分別進行Western blot和qPCR實驗。與對照組相比， oxLDL處理細胞后，adipophilin表達增加，Akt被活化，且隨著處理時間的延長，這種變化更明顯(P<0.01)；油紅O染色結(jié)果顯示，oxLDL處理后細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積增多，見圖1。

Figure 1. The effects of oxLDL on the expression of adipophilin, the activation of Akt and the accumulation of intracellular lipids in RAW264.7 cells. A: the mRNA expression of adipophilin was detected by qPCR; B: the protein expression of adipophlin and activation of Akt were determined by Western blot; C: Oil red O staining for detecting the intracellular lipid accumulation (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs12 h group.

圖1oxLDL對RAW264.7細胞內(nèi)adipophilin表達、Akt活化及脂質(zhì)蓄積的影響

2 LY294002處理可抑制oxLDL誘導的RAW264.7細胞內(nèi)adipophilin和p-Akt水平的升高和脂質(zhì)蓄積

如圖2所示，與未用LY294002處理組相比，當用LY294002預(yù)處理RAW264.7細胞1 h，再用50 mg/L oxLDL處理細胞24 h后，adipophilin蛋白和mRNA表達均下降，細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積減少，p-Akt蛋白水平降低，但較對照組要高(P<0.05)。

Figure 2. The effects of PI3K/Akt inhibitor LY294002 (LY) on the expression of adipophilin, the activation of Akt and the accumulation of intracellular lipids in RAW264.7 cells. A: the mRNA expression of adipophilin was detected by qPCR; B: the protein expression of adipophlin and activation of Akt were determined by Western blot; C: Oil red O staining for detecting the intracellular lipid accumulation (×100). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs24 h group.

圖2PI3K/Akt抑制劑LY294002對RAW264.7細胞內(nèi)adipophilin表達、Akt活化及脂質(zhì)蓄積的影響

3 高表達adipophilin影響Akt的活性

用EcoRⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶將目的片段和pCMV-Tag2B載體在37 ℃酶切，用T7 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化入DH5α、擴大培養(yǎng)、酶切、測序鑒定，結(jié)果顯示，酶切片段大小符合預(yù)期，約為1 314 bp，測序后行BLAST顯示序列正確，見圖3。當HEK293細胞轉(zhuǎn)入pCMV-Tag2B-adipophilin質(zhì)粒使adipophilin高表達后，p-Akt的蛋白水平升高，見圖4。

4 Adipophilin與Akt蛋白的相互作用關(guān)系

既然adipophilin高表達可促進細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積與Akt密切相關(guān)，那么adipophilin與Akt蛋白之間是否存在相互作用呢？本研究將帶有Flag標簽的adipophilin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞48 h后，裂解細胞并加入抗Flag抗體進行免疫共沉淀實驗，Western blot檢測使用抗Akt抗體。結(jié)果未能觀察到adipophilin與Akt蛋白之間存在相互作用，見圖5，其作用的具體分子機制有待進一步探討。

討 論

AS是心血管疾病的主要原因，其發(fā)生發(fā)展是多種細胞與分子參與的復(fù)雜過程。單核/巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和血小板等是AS發(fā)生發(fā)展的生物學基礎(chǔ)。Adipophilin是一種不完全包被蛋白，在正常狀態(tài)下，它主要位于細胞內(nèi)的新生脂滴周圍。國內(nèi)外研究證明，adipophilin與泡沫細胞的形成密切相關(guān)，在AS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其作用的具體機制還不是很明確。

Figure 3. The enzyme-digested products of pCMV-Tag2B-adipophilin recombinant vector. The lanes 1～4 were the enzyme-digested products of pCMV-Tag2B-adipophilin recombinant vector. The size of the target fragment was 1 314 bp. The lanes 5～8 were the enzyme-digested products of empty plasmid. M: 1 kb DNA marker.

圖3pCMV-Tag2B-adipophilin載體酶切產(chǎn)物電泳圖

Figure 4. The effect of adipophilin over-expression on the activation of Akt in HEK293 cells. A: the mRNA expression of adipophilin was detected by qPCR; B: the protein expression of adipophilin and activation of Akt were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4Adipophilin過表達對HEK293細胞內(nèi)Akt活性的影響

Figure 5. The protein interaction between adipophilin and Akt was determined by CoIP. HEK293 cells were transfected with pCMV-Tag2B-adipophilin expression vector or empty vector. The cell lysates were immunoprecipitated (IP) and detected by Western blot (WB) with the indicated antibodies.

圖5CoIP檢測HEK293細胞內(nèi)adipophilin與Akt蛋白之間的相互作用

近年來，關(guān)于PI3K/Akt信號通路對AS調(diào)控的研究不斷深入。作為重要催化酶，PI3K在調(diào)節(jié)具備第二信使特征脂類衍生物生成中發(fā)揮重要作用，影響AS的進程[7-8]。血管生成素Ⅰ能誘導單核細胞的趨化而促進AS的發(fā)展，PI3K是這一過程不可或缺的環(huán)節(jié)[9]；缺乏PI3K的巨噬細胞不能對趨化因子的刺激產(chǎn)生足夠的遷移[10]。PI3K/Akt信號通路是單核細胞促AS的分子基礎(chǔ)，本研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑抑制劑LY294002能減少細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，抑制泡沫細胞的形成，這與Yao等[11]和Konstantinidis等[12]的研究結(jié)果一致。此外，山柰酚可通過PI3K/Akt/mTOR通路上調(diào)自噬來緩解oxLDL誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡，且LY294002可增強山柰酚的作用，緩解AS的發(fā)生發(fā)展[13]。這些研究表明，PI3K/Akt通路在AS中發(fā)揮重要作用。

作為PI3K下游的重要功能分子，Akt及下游分子活性改變與心血管疾病有關(guān)。在動脈粥樣斑塊組織中可檢測到血管內(nèi)皮細胞衰老表型[14]，Miyauchi等[15]也發(fā)現(xiàn)了相似的細胞表型變化，并在動脈粥樣斑塊中檢測到磷酸化的Akt。本研究也發(fā)現(xiàn)，當用oxLDL處理細胞后，Akt明顯被活化，細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積增多；而抑制Akt的活性后，能明顯減少細胞內(nèi)的脂質(zhì)積聚，提示Akt參與細胞內(nèi)的脂質(zhì)蓄積和AS的發(fā)生。

袁中華等[4]的研究結(jié)果表明，adipophilin在巨噬細胞中能促進炎癥因子的表達，抑制Akt的活化可明顯抑制血管細胞黏附分子1和細胞間黏附分子1的表達，進而緩解AS的進展[16]。本研究并未發(fā)現(xiàn)adipophilin與Akt蛋白之間存在著直接的相互作用，但抑制Akt后，adipophilin表達下調(diào)，細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積減少；過表達adipophilin可使Akt活性增強。表明adipophilin促進細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積伴隨著Akt的活化，這可能與adipophilin通過Akt誘導炎癥因子的表達有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，adipophilin促進細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積與Akt的活化密切相關(guān)。目前，在哺乳動物和人體中有3種形式的Akt，即Akt1、Akt2和Akt3，盡管3個亞型具有相似性，但其發(fā)揮作用依據(jù)其亞型不同而異。將ApoE-/-/Akt1-/-雙敲除小鼠的骨髓干細胞注射入ApoE-/-小鼠體內(nèi)，給予高膽固醇飲食后發(fā)現(xiàn)，Akt1敲除可引起ApoE-/-小鼠嚴重的As，Akt1缺失可明顯上調(diào)炎癥介質(zhì)，使單核/巨噬細胞更易在血管壁粥樣斑塊中聚集[17]。Akt2缺失可減少LDLR-/-小鼠主動脈內(nèi)動脈粥樣病變進展[18-19]。而將ApoE/Akt3雙敲除小鼠的骨髓干細胞注射入ApoE-/-小鼠體內(nèi)，給予高膽固醇飲食后發(fā)現(xiàn)，Akt3缺失可通過提高?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1的表達，增加泡沫細胞形成，進而促進小鼠動脈粥樣硬化[20]。從這些研究不難看出，Akt的每個亞型在動脈粥樣硬化中發(fā)揮著不同的作用，我們可以通過對Akt不同亞型的研究，進一步明確adipophilin在AS中發(fā)揮作用的具體機制。

總之，adipophilin可通過Akt的活化促進細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，但要證明蛋白之間不存在相互作用仍需進一步驗證。本實驗結(jié)果為明確adipophilin在AS的進程中發(fā)揮作用的機制提供了實驗依據(jù)。