劉啟方， 黃 晶▲， 徐 敏

(貴州省人民醫(yī)院 1心內(nèi)科， 2康復(fù)科， 貴州 貴陽(yáng) 550002)

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱(chēng)冠心??；coronary atherosclerotic heart disease，CHD)嚴(yán)重影響人類(lèi)生命健康。近年來(lái)，冠心病的治療方案得到飛速的發(fā)展，其中冠狀動(dòng)脈內(nèi)血運(yùn)重建是其主要的治療策略。然而,大量的研究證明缺血后的心肌重新恢復(fù)血流灌注同樣會(huì)導(dǎo)致心肌損傷加重及心肌細(xì)胞凋亡。因此，阻止缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損害和細(xì)胞凋亡對(duì)改善心臟功能，降低死亡率具有重要的意義。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類(lèi)小的非編碼RNA分子，依靠調(diào)控多個(gè)蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生巨大的影響，它們影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡[1-3]。miR-25是miR-106b～25家族中的一個(gè)成員，在心血管疾病中，miR-25作為在心臟中相對(duì)高表達(dá)的miRNA，參與心臟重構(gòu)和心力衰竭等許多病理生理的調(diào)節(jié)[4-6]。部分研究推測(cè)miR-25在心肌細(xì)胞中表達(dá)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的作用。H9c2心肌細(xì)胞是源來(lái)于胚胎期心臟組織的細(xì)胞，許多生物學(xué)活性與原代心肌細(xì)胞相似。本研究通過(guò)構(gòu)建高表達(dá)miR-25的H9c2穩(wěn)定細(xì)胞系，探討miR-25的表達(dá)變化對(duì)缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用以及其作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

心肌細(xì)胞株H9c2來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P生物公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；RIPA裂解液(強(qiáng))、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒和BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物有限公司； 抗cleaved capase-3、高遷移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)和Bcl-2抗體購(gòu)自Gibco；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas；pRNAT-U6.1/Neo vector購(gòu)自GenScript。慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建。

2 方法

2.1高表達(dá)miR-25 H9c2穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建 實(shí)驗(yàn)分為5組:空白對(duì)照(control)組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、LV-control組(轉(zhuǎn)染LV-control-miRNA micmic)、LV-miR-25組(轉(zhuǎn)染LV-miR-25 mimic)、LV-anti-control組(轉(zhuǎn)染LV-control-miRNA inhibitor)和LV-anti-miR-25組(轉(zhuǎn)染LV-miR-25 inhibitor),轉(zhuǎn)染后建立穩(wěn)定細(xì)胞株。選取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的H9c2細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對(duì)象，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液密度至1×108/L，取6孔培養(yǎng)板,每孔分別接種2 mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行慢病毒感染。向各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞懸液分別加入5 μL polybrene及慢病毒載體(LV-control-miRNA mimic、LV-miR-25 mimic、LV-anti-control-miRNA inhibitor和LV-anti-miR-25 inhibitor)，MOI=100，用吸管吹打均勻后接種于6孔板，6 h后加入新鮮培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)，待細(xì)胞完全貼壁后，更換新鮮DMEM培養(yǎng)基。動(dòng)態(tài)觀察感染細(xì)胞生長(zhǎng)密度，抗生素壓力篩選于細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上融合時(shí)進(jìn)行。觀察未感染的對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，而感染組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，表示壓力篩選成功。擴(kuò)大培養(yǎng)各感染組陽(yáng)性細(xì)胞。

2.2H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的建立 缺氧培養(yǎng)基的制備：取新鮮不含血清的DMEM培養(yǎng)液，制備前使用CO2和氮?dú)獾幕旌蠚怏w充分飽和DMEM培養(yǎng)基，飽和時(shí)間至少3 h 以上;復(fù)氧培養(yǎng)基制備:取含小牛血清的DMEM液，放置于37 ℃的常氧培養(yǎng)箱。按照Ekhterae等[7]構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型的方法，取出正常條件下培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞，加入混合氣體飽和過(guò)的缺氧培養(yǎng)基，放入低氧培養(yǎng)箱(37 ℃、1% O2、5% CO2、94% N2、100% 濕度)中培養(yǎng)，構(gòu)建缺氧模型；缺氧培養(yǎng)后，取出培養(yǎng)瓶，加入胰酶消化，1 000 r/min離心5 min;吸去上清液，加入復(fù)氧培養(yǎng)基,放置37 ℃的常氧培養(yǎng)箱(95%空氣和5% CO2)中,繼續(xù)培養(yǎng)心肌細(xì)胞,構(gòu)建復(fù)氧模型。依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)行H9c2細(xì)胞缺氧24 h 后復(fù)氧1 h，構(gòu)建細(xì)胞凋亡模型。

2.3Real-time PCR檢測(cè)miR-25和HMGB1 mRNA的表達(dá) 用TRIzol RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。miR-25 的逆轉(zhuǎn)錄引物為5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGC-ACTG-GATACGACTCAGACC-3’。miR-25的上游引物為 5’-ATCCAGTGCGTGT-CGTG-3’，下游引物為5’-TGCTCATTGCACTTGTCTC-3’。PCR的擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃ 變性 10 s、60 ℃ 退火、延伸40 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。HMGB1的上游引物序列為5’-TATGGCAAAAGCGGACAAGG-3’，下游引物序列為5’-CTTCGCAACATCACCAATGGA-3’。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-25 和HMGB1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.4Western blot檢測(cè)HMGB1、Bcl-2和cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平 取待測(cè)細(xì)胞于EP管中，加入蛋白裂解液，離心沉淀提取全蛋白，Brad-ford 法測(cè)定蛋白濃度。行SDS-PAGE，半干法轉(zhuǎn)移凝膠至PVDF 膜，5% BSA 慢搖4 h封閉膜，TTBS 洗膜后分別加入兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗HMGB1單克隆抗體和兔抗cleaved caspase-3單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜，加入羊抗兔 II 抗，慢搖2 h后進(jìn)行ECL顯色，X線膠片顯影定影，將膠片進(jìn)行掃描，用圖像分析軟件Imageproplus 6.0對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率 本研究應(yīng)用Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡。將各組細(xì)胞以1×108/L接種于6孔板, 構(gòu)建缺氧/復(fù)氧損傷模型，根據(jù)雙染法試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作:用0.25%的胰酶在細(xì)胞培養(yǎng)孔中進(jìn)行細(xì)胞消化,待細(xì)胞收縮變成圓形時(shí),用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化。離心棄上清重懸細(xì)胞，加入10 mL Annexin V，室溫孵育15 min。采用200目濾網(wǎng)過(guò)濾，上流式細(xì)胞儀分析。細(xì)胞周期檢測(cè)分別用胰酶消化液消化并制成1×109/L的細(xì)胞懸液，離心棄上清。用PBS緩沖液洗2次，離心，棄上清。加入1 mL 70%預(yù)冷乙醇，吹打均勻，4 ℃固定過(guò)夜。PBS洗滌去乙醇，1 000 r/min 離心5 min，洗2遍。加入0.2 mL碘化丙啶，注意避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.6雙螢光素報(bào)告基因檢測(cè)miR-25與HMGB1的靶向作用 從NCBI中下載人HMGB1-3’UTR序列(NM_002128.4)，采用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳將擴(kuò)增條帶分離，擴(kuò)增條帶分離后, 將純化的擴(kuò)增片段收回，克隆到psiCHECKTM-2 載體，構(gòu)建HMGB1-3’UTR-psiCHECKTM-2與Mut-HMGB1-3’UTR-psiCHECKTM-2載體。將miR-25與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天取24孔培養(yǎng)板，每孔接種2×104個(gè)細(xì)胞，用含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，將脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒及miR-25溶液混合，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育5 h后，換新鮮的含血清DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后2 d，收集細(xì)胞裂解液。加入預(yù)先配好的用于螢光素酶檢測(cè)的工作液，采用生物發(fā)光檢測(cè)儀讀取背景值。

2.7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA的H9c2細(xì)胞系的構(gòu)建 轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA抑制HMGB1的表達(dá),將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞接種于6孔板上，第2天待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明將shRNA-HMGB1和control-shRNA分別轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、shRNA-HMGB1組和control-shRNA組。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48～72 h。轉(zhuǎn)染成功后行缺氧/復(fù)氧損傷處理，再檢測(cè)HMGB1表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功構(gòu)建高表達(dá)miR-25的穩(wěn)定細(xì)胞系

Real-time PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組H9c2細(xì)胞中miR-25的表達(dá)，結(jié)果顯示，相比于對(duì)照組，LV-miR-25組 H9c2心肌細(xì)胞中miR-25的表達(dá)水平顯著升高，LV-anti-miR-25組H9c2細(xì)胞中miR-25表達(dá)水平降低(P<0.01)，表明miR-25高表達(dá)和低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The relative expression of miR-25 detected by real-time PCR in the H9c2 stable cells with overexpression and silencing of miR-25. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖1miR-25在各組H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)

2 高表達(dá)miR-25的H9c2細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧條件下HMGB1表達(dá)降低

構(gòu)建miR-25高表達(dá)的H9c2穩(wěn)定細(xì)胞系后，建立缺氧/復(fù)氧損傷模型，分別收集不同轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞，用real-time PCR和Western blot法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞HMGB1的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于對(duì)照組，高表達(dá)miR-25的H9c2細(xì)胞中HMGB1表達(dá)明顯減少，轉(zhuǎn)染LV-anti-miR25 inhibitor后HMGB1表達(dá)顯著增加(P<0.01),可見(jiàn)miR-25的表達(dá)與HMGB1的mRNA表達(dá)在H9c2細(xì)胞中呈負(fù)相關(guān)，miR-25能夠抑制心肌細(xì)胞HMGB1的蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖2、3。

3 高表達(dá)miR-25的H9c2細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧條件下Bcl-2蛋白表達(dá)增加，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)減少

Western blot結(jié)果顯示，與control組及LV-control組相比，LV-miR-25組中Bcl-2的表達(dá)顯著升高，而cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)降低，提示細(xì)胞凋亡減少；LV-anti-miR-25組中cleaved caspase-3蛋白水平高于其它組，而B(niǎo)cl-2明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

Figure 2. The relative mRNA expression of HMGB1 detected by real-time PCR in the H9c2 stable cells with overexpression or silencing of miR-25 under the condition of H/R. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖2Real-timePCR檢測(cè)HMGB1mRNA在各組缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 3. The protein expression of HMGB1 determined by Western blot in H/R-treated cells in each group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖3Westernblot檢測(cè)HMGB1蛋白在各組缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞中的表達(dá)

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期變化

miR-25高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建后，制作缺氧/復(fù)氧H9c2細(xì)胞模型，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與control組及LV-control組相比， LV-miR-25組的凋亡細(xì)胞明顯減少，而LV-anti-miR-25組的凋亡細(xì)胞明顯增多(P<0.05),見(jiàn)圖5。

Figure 4. The levels of apoptosis-related proteins determined by Western blot. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group.

圖4Westernblot檢測(cè)Bcl-2和cleavedcaspase-3在各組H9c2心肌細(xì)胞中的蛋白水平

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，LV-miR-25組的S期細(xì)胞明顯增多，G1期減少； LV-anti-miR-25組的S期細(xì)胞減少，G1期增多(P<0.05)，提示細(xì)胞周期受到阻滯，見(jiàn)圖6。

5 雙螢光素報(bào)告基因檢測(cè)miR-25與HMGB1的靶向作用

用microRNA.org的Targets and Expression程序進(jìn)行HMGB1的miRNA預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-25與HMGB1存在潛在的靶向作用。通過(guò)分別轉(zhuǎn)染 miR-25 mimic、miR-25 inhibitor、NC-miRNA 或 NC-miRNA inhibitor和HMGB1-3’UTR-psiCHECKTM-2(野生型)與Mut-HMGB1-3’UTR- psiCHECKTM-2(突變型)的螢光素酶報(bào)告基因載體進(jìn)入H9c2細(xì)胞，測(cè)定螢光素酶活性的變化。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-25 mimic后，相對(duì)于空白對(duì)照組，攜帶有HMGB1野生型報(bào)告基因載體組的螢光素酶活性下降，而攜帶有HMGB1突變型報(bào)告基因載體組在轉(zhuǎn)染miR-25mimic后螢光素酶活性沒(méi)有明顯變化，表明miR-25靶向調(diào)控HMGB1基因，見(jiàn)圖7。

Figure 5. Analysis of apoptosis by flow cytometry in the H9c2 stable cell lines of each group. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的凋亡率變化

6 轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA降低缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA組的HMGB1表達(dá)明顯降低，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖8。對(duì)干擾HMGB1表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系行缺氧/復(fù)氧損傷，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA組的細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖9。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)顯示,與control-shRNA相比，HMGB1-shRNA組晚期凋亡細(xì)胞聚集的右上區(qū)明顯減少；正常細(xì)胞聚集的左下區(qū)增多，轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA后，細(xì)胞的凋亡率與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖10。

討 論

細(xì)胞凋亡可由內(nèi)源性或外源因素所誘發(fā),缺血和氧化應(yīng)激均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。Gottlieb等[9]在離體兔心肌灌注模型中發(fā)現(xiàn)缺血30 min再灌注4 h后心肌細(xì)胞出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變,進(jìn)一步研究證實(shí)再灌注損傷的心肌有大量的凋亡細(xì)胞，而單純?nèi)毖男募〖?xì)胞中未檢測(cè)到細(xì)胞凋亡，據(jù)此他們推測(cè)細(xì)胞凋亡是缺血/再灌注損傷中特征之一，因此減少缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡具有重要的意義。在缺血再灌注損傷的心肌中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡保護(hù)蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減低，凋亡蛋白caspase-3表達(dá)明顯增加,提示心肌細(xì)胞凋亡增加。在心肌細(xì)胞高表達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-xL，能減少缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞凋亡和梗死面積[10-12]。細(xì)胞凋亡與Bcl-2和caspase-3表達(dá)水平密切相關(guān)，檢測(cè)Bcl-2和caspase-3能反應(yīng)細(xì)胞凋亡的程度，本研究通過(guò)檢測(cè)Bcl-2和caspase-3的表達(dá)水平間接反應(yīng)細(xì)胞凋亡的程度。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒構(gòu)建高表達(dá)miR-25的穩(wěn)定細(xì)胞系后，行缺氧/復(fù)氧處理，結(jié)果提示高表達(dá)miR-25的Bcl-2 蛋白表達(dá)增加，而cleaved caspase-3的蛋白水平減少，細(xì)胞凋亡率明顯減少；細(xì)胞周期檢測(cè)S期細(xì)胞明顯增加。轉(zhuǎn)染 miR-25抑制劑構(gòu)建干擾miR-25的穩(wěn)定細(xì)胞系組，得到相反的結(jié)果。由此推斷miR-25對(duì)缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致H9c2心肌細(xì)胞具有促進(jìn)增殖，抑制凋亡的作用。Jeanine等[4]在研究急性冠脈綜合征患者miRNA差異性表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，急性冠脈綜合征患者高表達(dá)miR-25，并推測(cè)其具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，防止細(xì)胞凋亡的功能,本研究得到的結(jié)果與其推測(cè)是一致的。

該研究同樣發(fā)現(xiàn)通過(guò)構(gòu)建高表達(dá) miR-25的穩(wěn)定細(xì)胞系后，行缺氧/復(fù)氧處理，高表達(dá)miR-25組的HMGB1表達(dá)顯著降低。HMGB1作為炎癥因子，廣泛參與不同組織和細(xì)胞病理生理變化。Jan等[13]研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷患者HMGB1表達(dá)增加，通過(guò)Toll樣受體2引起細(xì)胞凋亡和壞死，抑制HMGB1的表達(dá)或給予HMGB1抑制劑(HMGB1 A盒)可以減少缺血再灌注引起的心肌細(xì)胞損傷，改善心臟功能;Andrassy等[14]同樣發(fā)現(xiàn)HMGB1通過(guò)晚期糖基化終產(chǎn)物受體途徑引起心肌細(xì)胞損害，抑制HMGB1的表達(dá)或給予HMGB1抑制劑可降低心肌細(xì)胞損害和心功能惡化。由此可見(jiàn)調(diào)控HMGB1的表達(dá)水平對(duì)減輕組織器官損傷具有重要意義。在組織細(xì)胞高表達(dá)miR-25下調(diào)HMGB1的表達(dá)水平，降低其與相關(guān)受體結(jié)合導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，最終達(dá)到減輕組織細(xì)胞的損傷，可能會(huì)成為一種新的治療策略。

Figure 6. The cell cycle distribution of H9c2 stable cell lines analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化

Figure 7. Dual-luciferase reporter assay confirmed thatHMGB1 was the target gene of miR-25.Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group.

圖7雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-25與HMGB1靶向關(guān)系

Figure 8. The protein expression of HMGB1 measured by Wes-tern blot in the H9c2 cells transfected with HMGB1-shRNA. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol-shRNA group.

圖8Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染HMGB1-shRNA后HMGB1的表達(dá)

Figure 9. The levels of apoptosis-related proteins determined by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol-shRNA group.

圖9Westernblot檢測(cè)Bcl-2和cleavedcaspase-3在各組缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細(xì)胞中蛋白水平的變化

Figure 10. The apoptosis of the H9c2 stable cell lines with silencing ofHMGB1 expression under the condition of H/R analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol-shRNA group.

圖10流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡率的變化

本研究證實(shí)了miR-25高表達(dá)具有降低細(xì)胞凋亡的作用，用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)程序發(fā)現(xiàn)miR-25序列與HMGB1存在潛在的靶向作用，進(jìn)一步采用雙螢光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-25對(duì)HMGB1有靶向調(diào)控作用，提示miR-25可能通過(guò)下調(diào)HMGB1表達(dá)發(fā)揮其降低細(xì)胞凋亡的作用。本研究轉(zhuǎn)染shRNA-HMGB1沉默HMGB1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，其 HMGB1表達(dá)降低，凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著升高，cleaved caspase-3的蛋白水平降低，細(xì)胞凋亡明顯減少。由此可見(jiàn)，在H9c2細(xì)胞的HMGB1參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，HMGB1表達(dá)降低減少了細(xì)胞凋亡。在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的過(guò)程中，miR-25高表達(dá)抑制了HMGB1的表達(dá)，而HMGB1表達(dá)減低能減少心肌H9c2細(xì)胞凋亡。因此我們推斷miR-25可經(jīng)HMGB1途徑參與心肌H9c2細(xì)胞凋亡。

然而，由于miRNA的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，同時(shí)不同的miRNA可以作用同一個(gè)基因。Vergoulis等[15]通過(guò)基因測(cè)序技術(shù)推測(cè)，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制物1C(cyclin-dependent kinase inhibitor 1C,CDKN1C)基因可能是miR-25調(diào)控的靶基因之一。Ward等[4]推測(cè)miR-25抗急性冠脈綜合征患者心肌細(xì)胞凋亡的功能是依靠調(diào)控CDKN1C表達(dá)，激活細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2(cyclin-dependent kinase 2， CDK2)實(shí)現(xiàn)的。盡管Ward等和Vergoulis等沒(méi)有從實(shí)驗(yàn)中證實(shí)推測(cè)結(jié)果，但大量的研究發(fā)現(xiàn)miR-25可以靶向調(diào)控TRAIL死亡受體，抑癌基因FBXW7及CDKN1C等，從而參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控[16]。本研究?jī)H僅證實(shí)miR-25可經(jīng)HMGB1途徑調(diào)控心肌H9c2細(xì)胞凋亡，但未能從更多途徑去探討miR-25調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能，應(yīng)對(duì)此繼續(xù)深入研究。