蔣持怡， 艾 琪， 劉 喆△， 胡鑫豪， 畢曉晨， 邵芳斐， 楊 洋

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 1第二臨床醫(yī)學(xué)院， 2第三臨床醫(yī)學(xué)院， 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 浙江 杭州 310053)

慢性腦低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)是指由高血壓、動脈硬化、頸動脈狹窄/閉阻和腦小血管病變等多種因素所引起長期的腦組織血流降低、供血不足的一種病理狀態(tài)，是認知功能障礙、血管性癡呆(vascular dementia，VD)和阿爾茨海默癥(Alzheimer disease，AD)等疾病的共同病理基礎(chǔ)[1-2]。目前對其導(dǎo)致認知障礙甚或癡呆的確切病理機制尚未完全闡明，研究普遍認為中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細胞凋亡是CCH典型的病理事件[3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)可通過眾多因素如細胞因子和生長因子的釋放，導(dǎo)致不同類型腦細胞之間產(chǎn)生復(fù)雜的相互作用，部分炎性因子在炎性損傷中起協(xié)同作用，從而加重腦缺血損傷，使認知功能逐漸惡化，其中關(guān)于白細胞介素1(interleukin-1, IL-1)和IL-6的研究最為廣泛[4]。新近研究證實Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與激活因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號通路在包括腦缺血性損害在內(nèi)的多種腦組織損傷與保護作用中發(fā)揮著重要作用，該通路是機體一條完整且廣泛存在的細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，與中樞細胞生長、增殖和存活及免疫反應(yīng)密切相關(guān)[5-7]。海馬神經(jīng)元最易遭受腦低灌注的影響，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)進而導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷，從而誘發(fā)認知障礙[8]。既往對于JAK/STAT信號通路的研究多集中在急性腦缺血損傷，而其在慢性腦低灌注病理過程中的作用及電針(electroacupuncture,EA)的干預(yù)影響報道甚少，本研究旨在觀察CCH大鼠海馬組織中JAK2/STAT3信號通路與海馬炎性損傷的關(guān)系以及電針干預(yù)對其影響，探索電針治療腦低灌注損傷所致認知障礙的作用機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及分組

健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠,體重(280±20) g，年齡3～6個月，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供(合格證編號：2008001659093；2008001660222)。手術(shù)、治療程序和動物福利的執(zhí)行嚴(yán)格按照國家衛(wèi)生機構(gòu)的動物實驗保健守則和浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心使用指南進行。大鼠生存環(huán)境為12 h光照和12 h黑暗周期，相對濕度45%～50%，溫度(22±2) ℃，適應(yīng)5 d。大鼠首先進行Morris水迷宮試驗，排除智力低下和無游泳能力者，確保實驗前大鼠的認知功能無明顯不同。篩選30只合格SD大鼠隨機分別行假手術(shù)(sham)組(10只)和造模手術(shù)組(20只)，造模后模型大鼠隨機分為模型(model)組和電針(EA)組。

2 儀器與試劑

華佗牌0.25 mm×25 mm針灸針(蘇州醫(yī)療用品有限公司)；LH-200E韓氏電針儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司)；PeriFlux 5000激光多普勒血流儀(Perimed)；Morris水迷宮系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)；VIP小動物專業(yè)吸入麻醉機(Matrx)；34-0313動物手術(shù)臺(Harvard Apparatus)；PCR擴增儀(Thermo)；Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳槽和Tran-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽(Bio-Rad)；ImageQuant LAS 4000超靈敏多功能成像儀(GE)。IL-6 與IL-1β ELISA試劑盒(R&D)；TriBlue RNA提取試劑盒(上海申能博彩生物有限公司)；兔抗p-JAK2抗體(Abcam)；抗p-STAT3和GAPDH抗體(CST)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)抗體(Jackson)。

3 方法

3.1動物模型的制備 手術(shù)組大鼠按Cechetti等[9]方法實行改良的雙側(cè)頸總動脈分部結(jié)扎術(shù)(bilateral common carotid artery occlusion，2VO)，制備CCH模型。術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。用異氟烷呼吸麻醉(5%誘導(dǎo)，2%維持)，分離雙側(cè)大鼠頸總動脈，避免損傷頸交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)，對右側(cè)頸總動脈用5/0絲線雙重結(jié)扎，1周后進行另一側(cè)操作。術(shù)中保持大鼠自主呼吸，維持肛溫于(37.0±0.5) ℃?？p合切口前施以適量青霉素鈉溶液預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠與手術(shù)組做相同切口，并分離雙側(cè)大鼠頸總動脈，不進行永久性結(jié)扎。術(shù)后所有動物送至原環(huán)境飼養(yǎng)。

3.2電針治療 電針組大鼠自術(shù)后第2天起接受電針治療，用固定器固定大鼠，遮蔽其眼睛，以保持相對舒適和安靜。參照《實驗針灸學(xué)》[10]進行大鼠的穴位定位，取百會穴(頂骨的正中處)及大椎穴(第7頸椎至第1胸椎之間位置，背部正中凹陷稍下處)，使用華佗牌0.25 mm×25 mm針灸針針刺。進針后采用LH-200E韓氏電針儀連接2穴，2/15 Hz疏密波，刺激強度(2±1) mA，時間30 min，每天1次(上午)，持續(xù)4周。假手術(shù)組和模型組僅進行抓取固定等平衡處理。

3.3大鼠認知功能評價 采用Morris水迷宮實驗進行認知行為學(xué)檢測[11]。(1)定位航行試驗：待電針組電針治療后，對3組大鼠進行導(dǎo)航實驗，入池位置為除平臺所在的象限，隨機選取其它3個象限1/2弧度處，將其頭朝上、面對池壁入水，每天2次，間隔15 min，連續(xù)5 d，記錄大鼠從入池到找到平臺的時間，取平均值；(2)空間探索實驗：航行實驗結(jié)束后的第1天進行探索實驗，除去池中的平臺，大鼠被允許自由游泳，入池位置為原平臺的對側(cè)象限。通過記錄大鼠在原平臺所在象限停留的時間對記憶功能進行評估，實驗進行2次，間隔15 min。采用圖像自動監(jiān)控及處理系統(tǒng)對實驗數(shù)據(jù)和圖像進行分析。

3.4采用多普勒腦血流儀對大鼠造模前、后30 min及處死前分別進行局部腦血流量(regional cerebral blood flow，rCBF)檢測 選取大鼠頭顱右側(cè)顳部為檢測點[12]，備皮、常規(guī)消毒，作一5 mm縱向切口并鈍性分離肌肉組織，暴露骨平面，雙氧水清理骨平面血漬，將探頭基座固定于骨平面。檢測時將多普勒腦血流儀探頭插入基座，待顯示屏上數(shù)值穩(wěn)定后進行監(jiān)測，記錄時間1 min。

3.5動物取材與處理 末次rCBF測量后，腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉，每組大鼠隨機取5只快速斷頭取腦，于冰上切取海馬組織，稱重，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩８鹘M其余動物在麻醉狀態(tài)下用4%多聚甲醛溶液經(jīng)心灌注，斷頭取腦4%多聚甲醛固定液中固定24 h，以備制作石蠟切片進行形態(tài)學(xué)觀察。

3.6ELISA法檢測各組大鼠海巴組織中IL-6和IL-1β的含量 按照試劑盒說明書，采用常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法測定海馬勻漿中IL-6和IL-1β含量。

3.7RT-PCR實驗 取凍存的海馬組織，逆轉(zhuǎn)錄步驟根據(jù)說明書指導(dǎo)，用TriBlue RNA提取試劑盒從海馬中抽提總RNA 2 μg。-40 ℃保存，備用于擴增反應(yīng)。引物采用Primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計，JAK2的上游引物為5’-GTTCTTACCGAAGTGCGTGCGA-3’，下游引物為5’-GGTAATGGTGTGCATCCGCAGTT-3’；STAT3的上游引物為5’-TGGAAGAGGCGGCAGCAGATAGC-3’，下游引物為5’-CACGGCCCC-CATTCCCACAT-3’；內(nèi)參照β-actin的上游引物為5’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’，下游引物為5’-AAAGAGGGTGTAAAACGCA-3’。

取出上述反應(yīng)液2 μL作為逆轉(zhuǎn)錄的模板，總反應(yīng)體系包括上、下游引物各0.5 μL，加Taq酶、dNTP、Mg2+-free Buffer及雙蒸水等補充至50 μL，混勻離心，放入PCR儀中進行擴增。預(yù)變性95 ℃ 5 min； JAK2： 95 ℃ 20 s、56 ℃ 40 s、72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)； STAT3： 95 ℃ 20 s、60 ℃ 40 s、60 ℃30 s，共30個循環(huán)； β-actin： 94 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s、72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)分析拍照，比較目的基因與內(nèi)參基因條帶的平均密度，以兩者比值表示mRNA相對表達量。

3.8Western blot檢測蛋白水平 取150～200 mg凍存大鼠海馬組織，加入由RIPA裂解液，超聲破碎儀冰上勻漿，離心提取上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆脵z測，BCA法測定蛋白濃度。配置10%分離膠和5%濃縮膠，加入樣本進行SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)膜； 5% BSA常溫封閉1 h，加入抗p-JAK2(1 ∶800)、p-STAT3(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜；次日取出用TBST搖床漂洗3次，每次10 min，后加入辣根抗氧化物酶標(biāo)記的 II 抗，常溫搖床孵育2 h，TBST搖床漂洗3次,每次10 min，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，采用ImageQuant TL軟件對條帶灰度值進行半定量分析。

3.9海馬HE染色 常規(guī)石蠟切片(5 μm)，切片脫蠟梯度至水，染色過程略如：蘇木素染色、氨水分化、伊紅復(fù)染；乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察海馬組織的病理變化。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

運用SPSS 15進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。導(dǎo)航實驗采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的多因素方差分析。腦血流測定的組內(nèi)干預(yù)前后對比采用配對t檢驗，其余各指標(biāo)組間對比采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。此外，方差齊性的數(shù)據(jù)采用t檢驗，而方差不齊的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 認知功能評估

1.1定位航行實驗結(jié)果 隨訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠平均逃避潛伏期除第 1天各組間差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性外，其余4 d均呈下降趨勢。模型組的潛伏期與同時點(第2、3、4和5天)假手術(shù)組比較減少緩慢，潛伏期顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)；電針組平均逃避潛伏期減少較快，與同時點假手術(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，而較模型組潛伏期顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明電針干預(yù)能有效改善CCH大鼠學(xué)習(xí)能力,見圖1。

Figure 1. The escape latency in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;△P<0.05vsmodel group.

圖1各組逃避潛伏期的比較

1.2空間探索實驗結(jié)果 經(jīng)過4周電針治療后，模型組在平臺所在象限停留時間比假手術(shù)組明顯縮短(P<0.05)，而電針組較模型組顯著延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,表明電針能改善CCH大鼠的記憶能力，見圖2。

Figure 2. Comparison of residence time of each group in the original platform quadrant. Mean±SD.n=10.△P<0.05vssham group;▽P<0.05vsmodel group.

圖2各組在原平臺象限停留時間的比較

2 rCBF的改變

2.12VO術(shù)前與術(shù)后rCBF的比較 術(shù)前假手術(shù)組與手術(shù)組大鼠rCBF的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，表明實驗大鼠無個體差異；術(shù)后30 min手術(shù)組大鼠的rCBF較假手術(shù)組有明顯下降(P<0.01)，表明手術(shù)造模成功，見表1。

2.2電針干預(yù)對模型大鼠rCBF的影響 經(jīng)4周干預(yù)后模型組和電針組大鼠的rCBF均有顯著恢復(fù)，但2組大鼠rCBF與假手術(shù)組相比仍顯著降低(P<0.01或P<0.05)，而電針組大鼠的rCBF與模型組相比顯著增加(P<0.05)，表明電針能改善CCH大鼠局部腦血流循環(huán),見表1。

表1造模前后局部腦血流量的變化情況

Table 1. The changes of regional cerebral blood flow before and after modeling (PU. Mean±SD)

GroupPreoperativePostoperativeAfter4weeks Sham122．41±9．66(n=10)120．21±8．46(n=10)122．13±8．82(n=10) Model124．53±13．99(n=20)38．44±5．44△△(n=20)84．01±5．71△(n=10) EA--107．14±9．57△#(n=10)

△P<0.05,△△P<0.01vssham group;#P<0.05vsmodel group.

3 電針干預(yù)對大鼠海馬IL-6和IL-1β含量的影響

ELISA檢測顯示，模型組大鼠海馬IL-1β和IL-6較假手術(shù)組增多(P<0.05)；電針組的IL-1β濃度較模型組顯著降低(P<0.05)，而IL-6濃度較模型組有所升高但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性,表明電針干預(yù)可維持IL-6表達、抑制IL-1β表達，見圖3。

Figure 3. The changes of IL-6 and IL-1β concentrations in the hippocampus. Mean±SD.n=5.△P<0.05vssham group;▽P<0.05vsmodel group.

圖3海馬IL-6和IL-1β濃度的變化

4 電針干預(yù)對模型大鼠海馬組織JAK2和STAT3 mRNA表達的影響

與假手術(shù)組相比，模型組JAK2和 STAT3的mRNA表達均有降低(P<0.05)；而電針組比模型組JAK2和 STAT3的mRNA表達明顯升高(P<0.05)，見圖4、表2。

Figure 4. The results of RT-PCR for detecting the mRNA expression of JAK2 and STAT3.

圖4RT-PCR檢測JAK2和STAT3的mRNA表達

表2海馬JAK2/STAT3的mRNA表達和磷酸化蛋白水平的變化

Table 2. The changes of mRNA expression of JAK2 and STAT3 and the protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 in the hippocampus (Mean±SD.n=5)

GroupmRNAProteinJAK2STAT3p?JAK2p?STAT3 Sham1．22±0．071．25±0．090．32±0．040．26±0．04 Model0．97±0．07△0．73±0．11△0．20±0．03△0．15±0．03△ EA1．11±0．05▽0．98±0．07▽0．29±0．05▽0．24±0．03▽

△P<0.05vssham group;▽P<0.05vsmodel group.

5 電針干預(yù)對模型大鼠海馬p-JAK2和p-STAT3 蛋白表達的影響

模型組與假手術(shù)組相比，p-JAK2和 p-STAT3蛋白表達含量均顯著降低(P<0.05)；而電針組比模型組的p-JAK2和 p-STAT3蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖5、表2。

6 海馬HE染色結(jié)果

假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)大多數(shù)神經(jīng)元胞體淡染，細胞形態(tài)完整；模型組CA1區(qū)有較多不規(guī)則形狀的深染細胞，表明受CCH的影響而出現(xiàn)神經(jīng)元死亡；而電針組CA1區(qū)深染細胞明顯較少，見圖6。

Figure 5. The protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 detected by Western blot.

圖5Westernblot檢測p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平

Figure 6. The observation of the pathological changes in hippocampal tissues with HE staining (×40).

圖6海馬HE染色結(jié)果

討 論

本研究組既往證實電針“百會”、 “大椎”可改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能、病理損傷，提高慢性腦低灌注模型rCBF、抑制海馬炎癥反應(yīng)及神經(jīng)損傷進而改善學(xué)習(xí)記憶功能[13-15]。督脈為“陽脈之?！保溲小安⒂诩估?，上至風(fēng)府，入腦”，百會、大椎二穴均屬于督脈，而百會為足太陽、手足少陽、足厥陰與督脈之會，可疏通腦絡(luò)、益智安神；大椎為“諸陽之會”，有疏通多經(jīng)、強臟腑之功。故針刺二穴可疏通氣血、醒腦開竅、益智安神。因此本實驗者根據(jù)以往實驗經(jīng)驗沿用百會、大椎穴。選用2/15 Hz的疏密波進行電針干預(yù)。該波頻率在2次/秒與15次/秒之間不斷變頻，其刺激作用較強，可調(diào)節(jié)血管舒縮功能，改善血液循環(huán)，促進神經(jīng)功能修復(fù)，并能有效調(diào)節(jié)血壓，故為本實驗選用。

海馬在外顯記憶神經(jīng)通路的組成中起著重要的作用，可定位環(huán)境中的物體、連接斷續(xù)的信息及維持空間學(xué)習(xí)能力，同時直接參與信息的儲存和記憶[16]。因其具有獨特的血管構(gòu)筑[8, 17]，加之小膠質(zhì)細胞密集[18]，使海馬成為腦內(nèi)缺血性損傷的最敏感和炎癥反應(yīng)易發(fā)區(qū)域。慢性腦低灌注是指腦血流速度降低、引起腦組織灌注不足，多種原因可引起大腦CCH，引發(fā)腦缺血、缺氧狀態(tài)，繼而出現(xiàn)持久性或進展性認知功能障礙[1-2]，因此CBF是反映腦功能的有效替代指標(biāo)[19]。大鼠2VO模型被廣泛用于CCH所致的認知功能損害相關(guān)研究，2VO模型可導(dǎo)致皮質(zhì)總體CBF以及海馬CBF分別下降為對照水平的35%～45%和60%，而空間學(xué)習(xí)和記憶也隨之受到明顯損害[1-3]。激光多普勒組織血流測量儀可持續(xù)、實時監(jiān)測局部腦血流量，本實驗采用激光多普勒組織血流儀對各組動物造模前、后及干預(yù)后的大腦rCBF分別進行了監(jiān)測，結(jié)果顯示電針干預(yù)可顯著提高模型動物rCBF，改善模型動物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。

CCH狀態(tài)下的缺血缺氧可誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)細胞變性、凋亡及海馬結(jié)構(gòu)受損，并進一步造成認知障礙[1-3]。在炎癥免疫因子中，IL-1β和IL-6與中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血性損傷密切相關(guān)，可導(dǎo)致白質(zhì)脫髓鞘、少突膠質(zhì)細胞凋亡、血栓形成、白細胞浸潤、血腦屏障破壞等[1-3]。其中IL-1是引發(fā)免疫和炎癥反應(yīng)的重要炎癥因子，可加重缺血性腦損傷，尤其是IL-1β與腦缺血發(fā)病機制密切相關(guān)[20]。IL-1β的異常升高可以誘發(fā)神經(jīng)元凋亡、功能紊亂，影響乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能和情感障礙等[21]。本實驗同樣觀察到CCH可導(dǎo)致海馬IL-1β水平增高、海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞呈現(xiàn)壞死或凋亡樣形態(tài)改變，而電針干預(yù)可降低IL-1β含量，減少神經(jīng)細胞的損傷改變。IL-6是中樞重要的多功能細胞因子之一，在生理狀態(tài)下的IL-6參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)并與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)；而其在疾病進程中的作用相互矛盾，這主要取決于不同的病理狀態(tài)[22-23]。有研究證實在藥物誘導(dǎo)疾病模型中，IL-6通過活化JAK2/STAT3而發(fā)揮神經(jīng)保護、改善認知功能的作用[24]。本研究觀察到電針干預(yù)可降低模型大鼠海馬IL-1β含量，而維持IL-6在較高的水平，推測其可能與影響JAK2/STAT3信號通路有關(guān)。

為深入探究IL-6對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用，本研究采用RT-PCR法觀測了與其密切相關(guān)的下游信號JAK-STAT通路的表達情況。IL-6可通過與細胞表面相應(yīng)受體結(jié)合刺激胞內(nèi)JAKs表達活化，活化的JAKs促使STATs蛋白磷酸化形成二聚體而發(fā)生核位移，進而調(diào)節(jié)目的基因的表達以影響細胞活動[7]。在缺血性腦損傷的研究中顯示，IL-6可提高和活化STAT3,進而調(diào)節(jié)目的基因SOD2表達增加,參與抗氧化和抗炎反應(yīng)，而敲除或阻斷IL-6信號則可加重腦缺血損傷[25-26]。本實驗觀察到電針干預(yù)可使海馬IL-6處于較高水平，而與之相應(yīng)的是JAK2/STAT3 mRNA表達以及磷酸化的JAK2/STAT3蛋白含量均有顯著增高，表明電針干預(yù)調(diào)節(jié)CCH后期IL-6水平,進而刺激海馬JAK2/STAT3的表達，推測這可能與電針提高CCH大鼠rCBF、降低IL-1β含量、進而改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)。

綜上分析，我們認為研究可以獲得初步結(jié)論，電針刺激百會和大椎穴提高慢性腦低灌注后rCBF、改善學(xué)習(xí)記憶能力，可能與調(diào)節(jié)IL-6/JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制海馬炎性損傷有關(guān)。