倪崢飛，顧 曄，馮永巍，薛慶海，王 琴

(無(wú)錫產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 無(wú)錫 214101)

丁香酚類化合物包括丁香酚、異丁香酚、甲基丁香酚、甲基異丁香酚等，自20世紀(jì)70年代初發(fā)現(xiàn)該類化合物對(duì)魚類有強(qiáng)烈的麻醉作用至今，以其高性價(jià)比在水產(chǎn)運(yùn)輸領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。丁香酚、異丁香酚對(duì)魚類、甲殼類水產(chǎn)品都具有較好的麻醉效果[1]，分別以二者為主要成分制成的丁香油和AQUI-S[2-3]代表性漁用麻醉劑，其中均易殘留甲基丁香酚、甲基異丁香酚，進(jìn)而影響食品安全[4]。

目前，丁香酚類漁用麻醉劑的安全性在國(guó)際上仍存在較大爭(zhēng)議，特別是甲基丁香酚，國(guó)際研究機(jī)構(gòu)通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證明其對(duì)哺乳動(dòng)物具有致癌作用[5-7]。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局禁止丁香酚、異丁香酚和甲基丁香酚等成分作為新型獸藥流通使用[8]，同時(shí)終止了對(duì)丁香油作為非商品漁用麻醉劑使用的審批[9]，至今未批準(zhǔn)養(yǎng)殖鮭魚使用AQUI-S的申請(qǐng)[11]。但在新西蘭、智利等國(guó)家，AQUI-S可用于魚類和貝類的養(yǎng)殖和捕撈[3]。日本規(guī)定了丁香酚作為漁用麻醉劑使用時(shí)的藥浴劑量范圍50～200 mg/L和殘留限量值0.05 mg/L[10]。目前，我國(guó)對(duì)丁香酚類漁用麻醉劑的使用尚無(wú)明確規(guī)定，調(diào)查顯示，丁香油是我國(guó)水產(chǎn)品流通環(huán)節(jié)使用最廣泛的麻醉劑[12]。

丁香酚類化合物的檢測(cè)方法主要有紫外分光光度法[13]、毛細(xì)管電泳法[14]、氣相色譜法[15]、液相色譜法[16-18]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12,21]等。對(duì)于水產(chǎn)品等復(fù)雜基質(zhì)樣品，光譜法和色譜法雖然操作簡(jiǎn)單，但無(wú)法有效排除雜質(zhì)和背景干擾，檢測(cè)限高、靈敏度低。趙東豪等[12]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)負(fù)離子模式測(cè)定了魚肉和水中的丁香酚殘留，定量限分別為2.5 μg/kg和0.05 μg/L。孫鵬等[21]針對(duì)水產(chǎn)品建立了漂浮固化分散液-液微萃取結(jié)合UPLC-MS/MS的方法測(cè)定丁香酚，定量限為4.91 μg/kg。由于甲基丁香酚和甲基異丁香酚常混入丁香酚和異丁香酚麻醉劑產(chǎn)品中，影響食品安全，因此有必要建立一種快速、準(zhǔn)確的水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑多殘留檢測(cè)的分析方法。

本研究擬將固相萃取與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)結(jié)合，同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中4種丁香酚類麻醉劑的殘留量，希望為水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑的多殘留檢測(cè)提供技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

1290-6470型超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源及MassHunter 8.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；BiosafeAvarti J-E冷凍離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品；超純水儀：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；Oasis HLB固相萃取小柱(60 mg/3 mL)：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)、異丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.2%)、甲基丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.0%)、甲基異丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.6%)：美國(guó)Accustandard公司產(chǎn)品；正己烷、乙腈、乙酸乙酯、甲醇：均為色譜純，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級(jí)水，由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備；鯽魚、對(duì)蝦：均購(gòu)于超市，取可食部分經(jīng)高速組織搗碎機(jī)處理后備用。

丁香酚類麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：用乙腈配制1 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃避光保存，使用時(shí)用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.01%甲酸溶液，B為甲醇-乙腈(1∶3，V/V)；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；梯度洗脫程序：0～0.5 min(90%A)，0.5～1.5 min(90%～58%A)，1.5～7.5 min(58%A)，7.5～8 min(58%～10%A)，8～10 min(10%A)，10～11 min(10%～90%A)，11～13 min(90%A)。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)正、負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：正、負(fù)離子模式均為3 500 V；干燥氣、霧化氣、碰撞氣、鞘氣：均為高純氮?dú)?；鞘氣：溫?00 ℃，流速11.0 L/min，噴嘴電壓500 V；干燥氣：溫度350 ℃，流速5.1 L/min；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)和質(zhì)譜條件列于表1。

表1 丁香酚類麻醉劑的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MRM ion pairs and mass spectral parameters for eugenol derivatives anesthetics

注：*表示定量離子

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1樣品前處理 稱取2.00 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入5 mL正己烷，旋渦振蕩10 min，以6 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，殘?jiān)? mL正己烷按上述步驟重復(fù)提取1次，合并2次提取液，置于35 ℃水浴中，氮吹至近干，用3 mL 40%甲醇溶液復(fù)溶。

用3 mL甲醇和3 mL水活化HLB固相小柱，將樣品液以1 mL/min上樣，控制緩慢流速，用3 mL 40%甲醇溶液淋洗、2 mL甲醇洗脫，將全部洗脫液置于35 ℃水浴中，氮吹至不足0.5 mL，再用初始流動(dòng)相定容至1 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.2方法學(xué)驗(yàn)證 將4種丁香酚類麻醉劑混標(biāo)儲(chǔ)備液用初始流動(dòng)相配制成濃度分別為1、2.5、5、10、50、100、200 μg/L的混標(biāo)工作液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并考察其線性關(guān)系。

向陰性鯽魚、對(duì)蝦樣品中分別添加2.5、5、25 μg/kg丁香酚類麻醉劑混標(biāo)溶液，每個(gè)加標(biāo)水平制備6個(gè)平行樣品，按1.4.1節(jié)處理，以外標(biāo)法定量，考察樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、乙腈-水以及甲醇乙腈-水溶液作為流動(dòng)相的分離情況。結(jié)果表明，以甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，丁香酚和異丁香酚、甲基丁香酚和甲基異丁香酚2對(duì)同分異構(gòu)體均無(wú)法完全分離，這對(duì)質(zhì)譜分析產(chǎn)生干擾；以甲醇乙腈(1∶3，V/V)-水溶液為流動(dòng)相，且兩相體積比為58∶42時(shí)，譜圖基線平整穩(wěn)定，2對(duì)同分異構(gòu)體在7.5 min之前均達(dá)到完全分離，峰形尖銳、對(duì)稱、無(wú)拖尾，結(jié)果示于圖1。

圖1 10 μg/L丁香酚類麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 10 μg/L eugenol derivatives anesthetics standard solution

流動(dòng)相pH值對(duì)丁香酚類麻醉劑的質(zhì)譜響應(yīng)具有顯著影響，實(shí)驗(yàn)通過(guò)向流動(dòng)相中添加甲酸來(lái)控制其pH值，添加甲酸濃度分別為0.01%、0.05%、0.1%、0.2%時(shí)，比較獲得的目標(biāo)物信號(hào)。結(jié)果表明，甲酸濃度為0.01%時(shí)，甲基丁香酚和甲基異丁香酚的信號(hào)強(qiáng)度明顯提高，但進(jìn)一步提高甲酸濃度，則會(huì)抑制丁香酚和異丁香酚的質(zhì)譜響應(yīng)，故選擇甲酸添加濃度為0.01%。

2.1.2質(zhì)譜條件 4種丁香酚類麻醉劑的結(jié)構(gòu)式示于圖2。丁香酚和異丁香酚均有1個(gè)酚羥基，在電噴霧電離下，易丟失1個(gè)質(zhì)子形成[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰[22]。甲基丁香酚與甲基異丁香酚中酚羥基被甲氧基取代，在電噴霧電離下，易獲得1個(gè)質(zhì)子形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。

將1 mg/L丁香酚類麻醉劑混標(biāo)溶液進(jìn)樣。首先，選擇MS2Scan模式同時(shí)以正、負(fù)離子模式在m/z100～350范圍進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描。結(jié)果表明，負(fù)離子模式下，丁香酚和異丁香酚的[M-H]-(m/z163)信號(hào)較強(qiáng)；正離子模式下，甲基丁香酚和甲基異丁香酚的[M+H]+(m/z179)信號(hào)較強(qiáng)。由此，確定4種化合物的分子離子，然后選擇MS2SIM模式以各分子離子響應(yīng)最大化優(yōu)化碎裂電壓，確定碎裂電壓均為90 V。其次，選擇子離子模式，分別設(shè)定各母離子的碰撞能為10、20、30、40 eV，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，從各組分二級(jí)質(zhì)譜中分別選取2個(gè)無(wú)干擾、相對(duì)豐度較強(qiáng)的特征碎片離子，然后將相對(duì)豐度最強(qiáng)的碎片離子與母離子組成定量離子對(duì)，次強(qiáng)的碎片離子與母離子組成定性離子對(duì)。最后選擇MRM模式，分別優(yōu)化每對(duì)離子對(duì)的碰撞能，確定最優(yōu)值；并優(yōu)化電噴霧離子源參數(shù)(包括毛細(xì)管電壓、干燥氣、霧化氣、碰撞氣等)。質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)和質(zhì)譜條件參數(shù)列于表1。

圖2 丁香酚類麻醉劑的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structures of eugenol derivatives anesthetics

2.2 樣品提取條件的優(yōu)化

2.2.1提取液的選擇 丁香酚類麻醉劑屬于極性化合物，難溶于水，易溶于乙腈、乙醚等有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了正己烷、乙腈和乙酸乙酯對(duì)4種丁香酚類麻醉劑的提取效果，結(jié)果表明，3種有機(jī)溶劑的提取回收率均大于90%，示于圖3。乙腈試劑毒性大，且樣品濃縮速度顯著慢于正己烷和乙酸乙酯，易造成丁香酚類麻醉劑損失；乙酸乙酯提取樣品經(jīng)固相萃取凈化后，仍有明顯雜質(zhì)干擾，且基線噪音較大，靈敏度降低；正己烷提取的樣品，基線平穩(wěn)，雜質(zhì)干擾少，且氮吹濃縮速度相對(duì)較快。因此，選擇正己烷作為4種丁香酚類麻醉劑的提取溶劑。

圖3 不同有機(jī)溶劑對(duì)丁香酚類麻醉劑的提取回收率Fig.3 Recoveries of eugenol derivatives anesthetics extracted by hexane, acetonitrile or ethyl acetate

2.2.2固相萃取條件的優(yōu)化 分別采用3 mL不同體積分?jǐn)?shù)(10%～100%)的甲醇溶液對(duì)HLB小柱進(jìn)行丁香酚類麻醉劑的進(jìn)樣和淋洗實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)低于40%時(shí)，4種丁香酚類麻醉劑能較好地吸附于HLB小柱上，不會(huì)在上樣和淋洗時(shí)隨甲醇溶液過(guò)柱而損失，所以采用3 mL 40%甲醇溶液作為固相萃取的上樣液和淋洗液。

為確定洗脫液的體積，減少樣品濃縮時(shí)間，考察了1～5 mL甲醇洗脫4種丁香酚類麻醉劑的回收率，示于圖4。結(jié)果表明，2 mL甲醇足以將4種丁香酚類麻醉劑從60 mg/3 mL的HLB小柱上完全洗脫。

2.2.3氮吹水浴溫度對(duì)回收率的影響 丁香酚類麻醉劑具有一定的揮發(fā)性。為考察它們?cè)诘禎饪s時(shí)的穩(wěn)定性，本實(shí)驗(yàn)向5 mL甲醇中加入0.1 mL 1 mg/L的4種丁香酚類麻醉劑混標(biāo)溶液，設(shè)定水浴溫度分別為25、30、35、40、45 ℃，氮吹濃縮至不足0.5 mL，使用初始流動(dòng)相定容至1 mL，測(cè)定各組分的回收率，結(jié)果示于圖5。結(jié)果表明，水浴溫度為25、30、35 ℃時(shí)，4種丁香酚類麻醉劑的平均回收率約為97%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2.7%；而水浴溫度上升至45 ℃時(shí)，平均回收率降至90%以下，這可能是由于部分丁香酚類麻醉劑隨溫度升高揮發(fā)分解所致。為保證樣品回收率并縮短前處理時(shí)間，本研究采用35 ℃作為氮吹水浴溫度。

圖4 不同體積甲醇洗脫丁香酚類麻醉劑的回收率Fig.4 Recoveries of eugenol derivatives anesthetics correlated with the eluting volumes of methanol

圖5 不同氮吹溫度下丁香酚類麻醉劑的回收率Fig.5 Recoveries of eugenol derivatives anesthetics correlated with different temperatures of nitrogen blowing

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系和定量限 在1～200 μg/L范圍內(nèi)，4種丁香酚類麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2大于0.996。以定量離子的10倍信噪比確定丁香酚、異丁香酚的定量限(LOQ)均為2.5 μg/kg，甲基丁香酚和甲基異丁香酚的定量限均為1.0 μg/kg，結(jié)果列于表2。

2.3.2回收率和精密度 考察了4種丁香酚類麻醉劑的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，在2.5、5、25 μg/kg添加水平上，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行樣品，同時(shí)設(shè)1個(gè)空白對(duì)照，結(jié)果列于表3。丁香酚類麻醉劑的加標(biāo)回收率在77.6%～111.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～9.1%，可見(jiàn)該方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較好，能夠滿足獸藥殘留分析要求。

表2 丁香酚類麻醉劑的線性范圍、線性相關(guān)系數(shù)、定量限Table 2 Linear ranges, correlation coefficients (R2), limits of quantification (LOQs) of eugenol derivatives anesthetics

表3 水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑的加標(biāo)回收率和精密度Table 3 Recoveries and precision of eugenol derivatives anesthetics in aquatic products

2.3.3基質(zhì)效應(yīng) 通過(guò)比較空白樣品提取液添加混標(biāo)溶液與純?nèi)軇?biāo)液的離子響應(yīng)強(qiáng)度[23]，考察水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑的基質(zhì)效應(yīng)。設(shè)定基質(zhì)因子(matrix effect)%=基質(zhì)溶液中定量離子響應(yīng)值/純?nèi)軇┲卸侩x子響應(yīng)值，分別在2.5、50、200 μg/kg添加濃度下評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，添加濃度2.5 μg/kg的鯽魚樣品MRM色譜圖示于圖6。當(dāng)基質(zhì)抑制目標(biāo)組分的響應(yīng)時(shí)，基質(zhì)因子<100%；當(dāng)基質(zhì)增強(qiáng)目標(biāo)組分的響應(yīng)時(shí)，基質(zhì)因子>100%；若不存在基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)因子=100%。結(jié)果表明，水產(chǎn)品基質(zhì)對(duì)4種丁香酚類麻醉劑均產(chǎn)生一定程度的離子抑制，但在3個(gè)添加濃度下，基質(zhì)因子均在80%～100%之間，說(shuō)明所建立的固相萃取前處理方法的樣品凈化效果較好。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本法檢測(cè)了隨機(jī)購(gòu)買的30份市售鮮活水產(chǎn)品(包括10份鯽魚、10份鳊魚、10份對(duì)蝦)，所有樣品均未檢出丁香酚類麻醉劑。

圖6 2.5 μg/kg添加水平下的鯽魚樣品MRM色譜圖Fig.6 MRM chromatograms of standard addition concentration (2.5 μg/kg) of crucian samples

3 結(jié)論

本研究建立了固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)快速、同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中4種丁香酚類麻醉劑殘留量。樣品用正己烷提取，經(jīng)HLB固相小柱萃取凈化，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)正、負(fù)離子模式同時(shí)測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了一次性同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中4種丁香酚類麻醉劑殘留。該方法操作簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好，適用于水產(chǎn)品中丁香酚類麻醉劑多殘留的快速定性和定量分析。