勾新磊，劉偉麗,2，張 梅,2，高 峽,2，趙新穎,2

(1.北京市理化分析測試中心，有機(jī)材料檢測技術(shù)與質(zhì)量評價北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100089；2.北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心，北京 100089)

隨著生活水平的不斷提高，人們對美發(fā)有了更高要求，各種標(biāo)識有去屑、防脫、生發(fā)等功效的洗發(fā)育發(fā)類化妝品日益繁多[1]。然而，部分生產(chǎn)廠家利用洗發(fā)育發(fā)產(chǎn)品成分復(fù)雜、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善等空缺，在產(chǎn)品中添加米諾地爾、螺內(nèi)酯等臨床藥物，以增強(qiáng)抗脫發(fā)和去屑效果。米諾地爾、非那雄胺、酮康唑和螺內(nèi)酯是一類應(yīng)用廣泛的育發(fā)、生發(fā)藥物，在臨床上已被證實(shí)具有抑制頭皮毛囊變少，刺激毛根從而促進(jìn)毛發(fā)生長，逆轉(zhuǎn)脫發(fā)過程等作用。患者長期使用會對產(chǎn)品產(chǎn)生依賴，甚至出現(xiàn)刺激性皮炎、過敏、眩暈、肝功能下降、陽痿等癥狀[2-3]?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》2015版[4]規(guī)定：洗發(fā)育發(fā)產(chǎn)品中不得含有米諾地爾、酮康唑、螺內(nèi)酯等物質(zhì)。目前的檢測研究主要關(guān)注米諾地爾、螺內(nèi)酯和性激素等成分，而關(guān)于氟他胺、度他雄胺等新型藥物的報(bào)道較少。因此，建立洗發(fā)育發(fā)類化妝品中非法添加違禁藥物的檢測方法具有重要意義。

洗發(fā)育發(fā)類化妝品中違禁藥物的檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)[5]、液相色譜法(LC)[6-11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12-16]等。洗發(fā)育發(fā)類化妝品中植物提取物成分日益增多，基質(zhì)復(fù)雜多樣，TLC法和LC法容易出現(xiàn)假陽性。而LC-MS/MS法具有靈敏度高、檢出限低的特點(diǎn)，可以針對復(fù)雜基質(zhì)進(jìn)行多組分的定性和定量分析，廣泛用于違禁藥物的檢測。

本研究擬建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法快速檢測洗發(fā)育發(fā)類化妝品中6種違禁藥物，希望為該類化妝品中違禁藥物的檢測及監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Acquity超高效液相色譜儀，XEVO TQ串聯(lián)質(zhì)譜儀，Masslynx4.1工作站：美國Waters公司產(chǎn)品；KQ6000V超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水器：美國Millipore公司產(chǎn)品；CR22GⅢ 離心機(jī)：日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

米諾地爾、酮康唑：純度≥98%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；非那雄胺、氟他胺：純度≥98%，日本 TCI 公司產(chǎn)品；度他雄胺：純度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；螺內(nèi)酯：純度≥98%，阿達(dá)瑪斯試劑有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮：均為色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：由Milli-Q凈化系統(tǒng)制備；其他試劑均為分析純；洗發(fā)育發(fā)樣品：購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

6種藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1。

圖1 6種藥物的結(jié)構(gòu)式 Fig.1 Structural formulas of six drugs

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量的上述6種藥物標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇溶解定容，制得濃度均為1 000 mg/L的儲備液。分別準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制10 mg/L米諾地爾和氟他胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，其他目標(biāo)物濃度為1 mg/L的混合對照品儲備液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液于4 ℃保存。

1.4 樣品處理

稱取1 g樣品(精確到0.001 g)于10 mL具塞刻度離心管中，加入8 mL甲醇，渦旋30 s，超聲提取20 min，放涼后加甲醇至刻度線，振蕩、搖勻，以6 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；流動相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為甲醇；流速0.2 mL/min；梯度洗脫程序：0～6 min(10%～90%B)，6～8 min(90%B)，7～8.5 min(90%～10%B)，8.5～10 min(10%B)；柱溫35 ℃。

1.5.2質(zhì)譜條件 電噴霧正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；毛細(xì)管電壓3.0 kV；萃取電壓5.0 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流速650 L/h；錐孔氣流速20 L/h；其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)列于表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

取6種藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用蠕動泵單獨(dú)注入離子源，在正、負(fù)離子模式下全掃描，選擇合適的電離方式和準(zhǔn)分子離子峰。結(jié)果表明，在ESI+模式下，螺內(nèi)酯脫去乙?；蚧笊蒻/z341.2離子，其豐度較高，故選擇m/z341.2作為母離子[13]。其他5種藥物均可獲得較高豐度的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。確定母離子后，采用子離子掃描方式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，對子離子進(jìn)行篩選，以確定定量離子和定性離子。然后優(yōu)化離子源溫度、去溶劑氣溫度及流量、錐孔氣流量，使待測物的離子化效率達(dá)到最佳。6種藥物定量離子的裂解途徑列于表2。

表1 6種藥物的質(zhì)譜條件Table 1 MS/MS parameters for six drugs

注：*表示定量離子

表2 6種藥物定量離子的裂解規(guī)律Table 2 Fragmentation pathways of quantitative ions of six drugs

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相對目標(biāo)化合物分離效果的影響。結(jié)果顯示，以甲醇為有機(jī)相時，各待測物響應(yīng)穩(wěn)定，色譜峰形較好；而采用乙腈為有機(jī)相時，響應(yīng)值明顯降低。在流動相中加入甲酸，可提高目標(biāo)化合物的離子化效率，獲得更高的靈敏度。因此，實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相。6種藥物的疊加總離子流圖示于圖2。

2.3 提取條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了乙酸乙酯、丙酮、乙腈、甲醇作為提取溶劑在定容體積10 mL，超聲20 min時，對目標(biāo)化合物的提取效果。在100 μg/kg加標(biāo)水平下，不同提取劑的回收率示于圖3?？梢?，4種提取劑對酮康唑、螺內(nèi)酯、氟他胺、度他雄胺和非那雄胺均具有較好的提取效果，回收率均大于80%。以甲醇作為提取劑時，米諾地爾的回收率明顯大于其他3種溶劑；乙酸乙酯和丙酮對目標(biāo)物中脂類、高級醇類等物質(zhì)具有較好的溶解性，提取的雜質(zhì)較多；而乙腈價格高、毒性大。因此，選擇甲醇作為提取劑，6種藥物的回收率在89.4%～92.5%之間。

注：1.米諾地爾;2.酮康唑;3.螺內(nèi)酯;4.氟他胺;5.度他雄胺;6.非那雄胺圖2 6種藥物疊加總離子流色譜圖Fig.2 Combined total ion chromatogram of six drugs

圖3 不同提取溶劑對6 種藥物回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on recoveries of six drugs

進(jìn)一步考察提取時間對提取效率的影響。結(jié)果表明，20 min后，目標(biāo)化合物的回收率提高不明顯，所以確定超聲提取時間為20 min。

2.4 線性范圍與檢出限、定量限

以空白樣品逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制6種藥物的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中氟他胺濃度為5.0～1 000.0 μg/L，其他5種藥物濃度為0.5～100.0 μg/L。分別以各分析物的峰面積(y)對相應(yīng)的濃度(x)做線性回歸，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，以3倍和10倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，其結(jié)果列于表3。

表3 6種藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantitation of six drugs

2.5 回收率和精密度

在空白樣品中分別添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。氟他胺的3個加標(biāo)水平分別為50.0、500.0、1 000.0 μg/kg，其他5種藥物的加標(biāo)水平為5.0、50.0、100.0 μg/kg，每個添加濃度平行測定6次，結(jié)果列于表4。可見，不同濃度水平下，各待測物的平均回收率為84.0%～94.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～5.6%。

2.6 實(shí)際樣品分析

利用本方法檢測20個洗發(fā)育發(fā)化妝品樣品。結(jié)果表明，樣品中上述6種藥物的含量均低于其檢出限?？瞻讟悠吩诩訕?biāo)水平2下，測試液的疊加總離子流色譜圖示于圖4。

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定洗發(fā)育發(fā)類化妝品中6種違禁藥物。該方法操作簡便、檢出限低、準(zhǔn)確度高，能夠滿足洗發(fā)育發(fā)類化妝品中6種藥物的檢測要求，可為違禁藥物的檢測及監(jiān)控提供方法參考。

表4 回收率和精密度檢測結(jié)果Table 4 Results of precisions and recoveries

注：1.米諾地爾;2.酮康唑;3.螺內(nèi)酯;4.氟他胺;5.度他雄胺;6.非那雄胺圖4 空白樣品在加標(biāo)水平2下，測試液的疊加總離子流色譜圖Fig.4 Combined total ion chromatograms of black sample at spiked level 2