王 利，李躍瑞，于良民，藺存國

(1.中國海洋大學(xué)，化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，山東 青島 266100；2.中國船舶重工集團(tuán)公司第七二五研究所，海洋腐蝕與防護(hù)國防科技重點實驗室，山東 青島 266101)

海洋生物污損是指海水環(huán)境中污損生物在結(jié)構(gòu)物表面的聚集與附著，以及由此帶來的不良影響。海洋生物污損會增加船舶航行阻力和燃油消耗，降低海水冷卻系統(tǒng)熱交換效率，加快金屬材料腐蝕，對海洋設(shè)施和平臺等造成嚴(yán)重危害，因此采取措施防除海洋生物污損具有重要意義。在海生物污損防除方法中，涂刷防污涂料是最為經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。有機(jī)錫類防污劑因嚴(yán)重危害海洋生態(tài)環(huán)境，《控制船舶有害防污底系統(tǒng)國際公約》已完全禁止有機(jī)錫防污劑的使用[1]。

目前市場上以氧化亞銅類防污涂料為主，但由于銅元素可在海港富集，同樣危害生態(tài)環(huán)境，也面臨限用和禁用趨勢。因此，開發(fā)新型對環(huán)境友好、高效的防污材料勢在必行。

依靠良好的環(huán)境友好性和高效的防污性能，酶基防污技術(shù)逐漸發(fā)展為氧化亞銅、生物殺生劑等毒殺型傳統(tǒng)防污方法的重要替代技術(shù)之一[2-6]，而蛋白酶基于對污損生物黏附物質(zhì)良好分解作用，已成為酶基防污涂料中關(guān)鍵防污活性酶之一。Leroy[5,7]和Mariana[8]等研究了固定化枯草桿蛋白酶的防污性能，發(fā)現(xiàn)枯草桿菌蛋白酶能夠減少石莼孢子，硅藻和細(xì)菌的附著，有效降低硅藻的黏附強(qiáng)度，清除已附著細(xì)菌。Peres等[9]用含有木瓜蛋白酶涂層在地中海做了為期七個月的測試，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶具有優(yōu)良的防污作用。Nick Aldred研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶對藤壺分泌的膠質(zhì)有明顯的降解作用。

由于酶的活性及其穩(wěn)定性受到諸如海水溫度、pH值等海洋環(huán)境參數(shù)的影響，游離的酶在水溶液中的穩(wěn)定性較差，容易發(fā)生自消化反應(yīng)，使酶催化反應(yīng)難以控制，催化效率下降；另外防污酶中的蛋白酶除了能催化降解污損生物黏附蛋白質(zhì)，也能催化降解其他的酶。因此，防污酶在應(yīng)用過程中須通過載體材料包封以使之彼此隔離，即進(jìn)行酶的固定化處理。防污酶的固定化，使水溶性酶脫離溶液環(huán)境，極大提高了酶的穩(wěn)定性，并使酶在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)和重復(fù)利用，避免了酶的釋出、流失，從而發(fā)揮防污酶持久、高效的催化水解作用[10]。因此防污酶的固定化是酶基防污涂層技術(shù)發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)。

酶固定化載體主要分為無機(jī)載體和有機(jī)載體兩大類，在酶基防污涂層中，無機(jī)納米載體由于具有比表面積高，載酶量大[11-12]和易于在涂層中應(yīng)用等優(yōu)點而占據(jù)比較突出的位置。目前已有多種無機(jī)納米材料用于酶的固定，例如雙層氧化碳納米管[13]、納米二氧化鈦[14]、納米磁性粒子[15-17]、金納米顆粒[18]等。此外，納米二氧化硅由于價格低廉、易于制備、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并可以提高涂層硬度、抗沖擊性和耐磨性等機(jī)械性能而備受關(guān)注。

海洋環(huán)境是具有防污活性天然產(chǎn)物的重要來源，包括酶類物質(zhì)[19]，大多數(shù)產(chǎn)出蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的細(xì)菌多從海水中分離獲取[20]，直接從大型污損生物表面的生物膜分離菌株獲取防污酶的研究相對較少。研究表明，典型污損生物藤壺、貽貝等的甲殼分解現(xiàn)象與細(xì)菌產(chǎn)生的酶類物質(zhì)直接相關(guān)[21]，因此污損生物外殼生物膜中細(xì)菌產(chǎn)出的酶類物質(zhì)對于海洋防污具有積極的作用。

基于上述原因，本文選取一種從牡蠣外殼生物膜中分離獲取的菌株產(chǎn)生的蛋白酶[22]作為固定化與防污性能評價研究對象，以正硅酸乙酯為原材料，采用反相乳液聚合法制備了活性表面納米二氧化硅微球(NPSiO2)作為蛋白酶固定化材料，并通過共價結(jié)合法對防污蛋白酶進(jìn)行固定化。將固定化酶通過丙烯酸樹脂黏附于載玻片表面制備出測試樣片，通過貽貝足絲附著實驗和底棲硅藻的附著與脫除實驗測試了防污性能。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

藥品 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，正硅酸乙酯(TEOS)，氨水(28%)，戊二醛(50%)，環(huán)己烷，正己醇，曲拉通X-100，福林酚試劑等，以上試劑均從上海麥克林生化科技有限公司購得，牡蠣源菌株蛋白酶為自制。

儀器 離心機(jī)(TGL-20M)、紫外分光光度計(日立，U-2800)、場發(fā)射掃描電鏡(日本，ULTRA55)、傅里葉紅外光譜儀(美國，NICOLET 8700)、真空冷凍干燥機(jī)(ALPHA2-4/LD-PLUS)、生物附著強(qiáng)度測試系統(tǒng)[23](自制)。

1.2 載體制備

采用Dandavate等人的方法[24]，向2 000 mL三口瓶中加入500 mL環(huán)己烷，120 mL正己醇及118 mL曲拉通X-100，攪拌5 min至澄清，然后緩慢加入22.6 mL超純水作為分散相，繼續(xù)攪拌30 min，形成透明穩(wěn)定的反相微乳液，隨后再加入6.67 mL正硅酸乙酯及2 mL氨水，在室溫下連續(xù)攪拌24 h，用無水乙醇破乳，在10 000 r/min下離心10 min收集二氧化硅納米顆粒，再用無水乙醇清洗5次，在真空干燥箱中60 ℃下干燥6 h，得到納米二氧化硅微球(NPSiO2)。

1.3 蛋白酶的固定化

將NPSiO2分散于含有一定量APTES的甲苯中，超聲分散形成懸濁液，然后于80℃下攪拌回流6h，使得NPSiO2表面氨基化，離心收集，用無水乙醇清洗3次。

將氨基化NPSiO2超聲分散于一定量的磷酸鹽緩沖液中，通入氮氣，并加入戊二醛至濃度為分散體系的0.5%，在40 ℃下攪拌2 h，離心去除上清液，再用磷酸鹽緩沖液清洗3次，除去殘余戊二醛。將經(jīng)戊二醛交聯(lián)處理過的硅納米顆粒分散在磷酸鹽緩沖液中，加入一定量的蛋白酶溶液，在30 ℃下攪拌6 h。所制樣品通過磷酸鹽緩沖液清洗3次，然后通過真空冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，得到固定化蛋白酶。

1.4 NPSiO2與固定化蛋白酶的表征

通過場發(fā)射掃描電鏡觀察NPSiO2、NPSiO2-P形貌并分析粒徑；通過Zeta電位儀測定NPSiO2及固定化酶的Zeta電位，通過傅立葉變換紅外光譜儀(IR)分別測試NPSiO2、氨基化NPSiO2、戊二醛處理NPSiO2及固定化酶的基團(tuán)特征，分析蛋白酶的共價固定情況。

1.5 固定化蛋白酶活性測試

采用福林酚法測試固定化蛋白酶活性。首先將固定化酶加入到1 mL緩沖液中，置于35 ℃恒溫水浴中預(yù)熱2 min，然后加入濃度為1%的酪素溶液1 mL，搖勻，立即放于35℃水浴中保溫10 min。取出后迅速加入0.4 mol·L-1的三氯乙酸溶液2 mL，終止蛋白酶的催化水解反應(yīng)。取濾液1 mL加入碳酸鈉溶液5 mL，搖勻，然后加入1 mL的福林酚試劑使用液，在35 ℃水浴中顯色20 min，用分光光度計于680 nm波長下比色，記錄消光值。在同組試驗中活性最高點記為100%，其余試驗點活性與該點的比值為酶的相對活力，用百分?jǐn)?shù)表示。

1.6 固定化蛋白酶防污性能測試

1.6.1 底棲硅藻附著與脫除性能測試 選擇底棲硅藻——舟形藻作為固定化蛋白酶防污性能測試生物之一，考察固定化蛋白酶抑制舟形藻在試樣表面附著的情況。對照空白組為涂覆丙烯酸樹脂的載玻片，實驗組為表面黏附有固定化酶的丙烯酸樹脂涂片，所用固定化酶在最優(yōu)固定化條件下制備，載酶量達(dá)到穩(wěn)定值。將對照空白組和實驗組樣片浸入濃度為1.0×105個/L的硅藻溶液中，20 ℃下于人工氣候箱中培養(yǎng)3h。將樣片通過考馬斯亮蘭G250染色，然后分別于顯微鏡下隨機(jī)抽取10個視野，統(tǒng)計硅藻在樣品表面附著密度；通過生物附著強(qiáng)度測試系統(tǒng)在1.5 m/s流速下沖刷試樣表面，測試水流剪切條件下硅藻的脫除情況，從而考察蛋白酶對硅藻附著強(qiáng)度的影響。

1.6.2 固定化蛋白酶抑制貽貝足絲附著試驗 貽貝是一種世界范圍內(nèi)的典型污損生物，其足絲腺分泌足絲蛋白黏附于材料表面。本文將吐絲能力活躍的貽貝分別固定于空白組和實驗組試樣表面，分別設(shè)置3組平行樣，浸入天然海水中，4 h后觀察并統(tǒng)計貽貝足絲在樣品表面的附著數(shù)量，分析固定化蛋白酶對貽貝足絲附著行為的抑制性能。實驗組所用固定化酶與底棲硅藻附著實驗相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 APTES用量及戊二醛濃度對蛋白酶固定化的影響

如圖1所示，經(jīng)該流程完成NPSiO2的制備、氨基化與蛋白酶固定化。

圖1 防污蛋白酶固定化流程圖Fig.1 Porcedure of antifouling protease immobilization

通過有機(jī)元素分析儀測試氨基化NPSiO2失重顯示(見圖2)，氨基化NPSiO2失重率隨著硅烷偶聯(lián)劑APTES用量的增加而提高，當(dāng)APTES與NPSiO2重量比(mL/g)超過0.4時，失重率趨于穩(wěn)定，這表明APTES在NPSiO2表面的接枝達(dá)到最大程度。

蛋白酶與載體共價結(jié)合是連接劑戊二醛分別與蛋白酶氨基殘基和載體表面氨基反應(yīng)形成的，因此戊二醛含量對蛋白酶的固定化有直接的影響。從圖(3)可以看出，戊二醛質(zhì)量百分比濃度在0.25%～1.5%范圍內(nèi)，酶載量隨戊二醛濃度增大而增大，當(dāng)戊二醛濃度達(dá)到1.5%后，酶載量趨于穩(wěn)定。

圖2 APTES用量對氨基化NPSiO2失重率的影響Fig.2 Effect of APTES on weight loss of amino-functionalized NPSiO2

2.2 NPSiO2與固定化蛋白酶表征

通過NPSiO2的掃描電鏡照片(見圖4a)可以看出，硅納米顆粒為規(guī)則球形，顆粒大小均勻，粒徑在200 nm左右；硅納米顆粒表面固定蛋白酶后(見圖4b),微球的直徑?jīng)]有顯著的變化，仍為200 nm左右，但是受表面蛋白酶的影響，微球呈團(tuán)聚狀態(tài)。

圖4 NPSiO2掃描電鏡照片F(xiàn)ig.4 SEM images of (a)NPSiO2 and (b)NPSiO2-P

載體的Zeta電位反應(yīng)了其化學(xué)特性和表面電荷性質(zhì)[25]。NPSiO2氨基化后，其Zeta電位由-17.4 mV變?yōu)?4.3 mV，Zeta電位的絕對值明顯增大，納米粒子間靜電斥力增大，這減小了它們之間的碰撞頻率，可使其團(tuán)聚的幾率降低，從而提高了相對穩(wěn)定性。Zeta電位由負(fù)變?yōu)檎?，表明氨基硅烷接枝到了NPSiO2表面。

表1 NPSiO2的Zeta電位Table 1 Zeta potential of NPSiO2

NPSiO2(a)、氨基化NPSiO2(b)、戊二醛處理NPSiO2(c)、蛋白酶(d)、固定化蛋白酶(e)的傅里葉變換紅外光譜圖如圖5所示。

((a)NPSiO2,(b)氨基化NPSiO2,(c)戊二醛處理NPSiO2,(d)蛋白酶,(e)固定化蛋白酶。(a)NPSiO2, (b)amino-functionalized NPSiO2, (c)glutaraldehyde-treated NPSiO2, (d)protease, (e)immobilized protease.)
圖5 傅里葉變換紅外光譜圖
Fig.5 FTIR spectra

在NPSiO2的光譜圖中，于3 400 cm-1附近出現(xiàn)較寬的SiO—H特征伸縮振動吸收峰，在1 080 cm-1附近出現(xiàn)Si—O—Si特征伸縮振動吸收峰。氨基化NPSiO2在2 950 cm-1附近出現(xiàn)C—H伸縮振動吸收峰，于1 642和1 558 cm-1處出現(xiàn)N—H變形振動吸收峰，在3 100～3 500 cm-1間存在N—H的伸縮振動峰，與SiO—H特征伸縮振動吸收峰發(fā)生重疊。這些都與Zeta電位表征一致，說明NPSiO2實現(xiàn)氨基化改性。戊二醛處理后，在1 700 cm-1出現(xiàn)醛基的C=O的伸縮振動峰。隨后對防污蛋白酶進(jìn)行固定化，固定化后醛基在1 700 cm-1的吸收峰消失，防污蛋白酶在1 630～1 670 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)N—H變形振動吸收峰，這表明完成了蛋白酶在NPSiO2表面的共價固定。

2.3 固定化蛋白酶的環(huán)境適應(yīng)性

2.3.1 溫度對固定化蛋白酶活性的影響 在pH=6.5、20～50 ℃溫度范圍下，分別測試固定化酶和游離酶的活性。從圖6可以看出，游離酶和固定化酶的活性隨溫度變化而變化的趨勢是一樣的，都是隨溫度升高，它們的活性先增大后減??；游離酶的最適反應(yīng)溫度是25 ℃，固定化酶最適反應(yīng)溫度為35 ℃，固定化酶的最適反應(yīng)溫度相比于游離酶提高10 ℃，在50 ℃下，游離酶幾乎失活，而固定化酶保持有將近20%的活性，并且可以看出固定化酶保持較高活性的溫度范圍較寬。

圖6 溫度對蛋白酶活性的影響Fig.6 Effect of temperature on relative activity of protease

2.3.2 pH對固定化蛋白酶活性的影響 pH對游離酶和固定化蛋白酶酶活的影響如下圖所示，游離酶和固定化酶的最適pH分別為6和7，防污蛋白酶經(jīng)過改性納米二氧化硅固定后最適反應(yīng)pH向堿性偏移，在較為酸性環(huán)境中，固定化酶的相對活性也較高。此外，固定化酶在7～10范圍內(nèi)保持有較高的活性，可能因為蛋白酶與載體之間通過強(qiáng)有力的共價鍵作用在一起，從而穩(wěn)定了酶分子構(gòu)象，減小了pH變化對酶活的影響，相對于游離酶，固定化酶在較為寬泛的pH范圍區(qū)域具有較好的適應(yīng)性。

2.3.3 固定化酶儲存穩(wěn)定性 酶在儲存過程中是不穩(wěn)定的，會發(fā)生變性導(dǎo)致酶活變低。而在實際應(yīng)用中，酶活要有一定的保質(zhì)期，因此，酶的儲存穩(wěn)定性是一個重要參數(shù)[26]。

將固定化蛋白酶和游離酶儲存在4 ℃的環(huán)境下，不同時間后對固定化酶及游離酶的活性進(jìn)行測試，測試結(jié)果如圖8所示。在最初的20天時間內(nèi)，固定化酶的活性保持在80%以上，50天后，固定化酶仍保持一半以上的活性，而游離酶的活性只剩下16.6%，即固定化酶在儲存50天后活力為游離酶的3倍。游離酶由于分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在儲存時酶分子構(gòu)象易發(fā)生改變，而酶經(jīng)過共價固定后，酶分子構(gòu)象比較穩(wěn)定，儲存時酶活下降相對較慢，可以看出這種固定化方法改善了防污蛋白酶的儲存穩(wěn)定性，使酶活保持更長的時間。

圖7 pH對蛋白酶活性的影響Fig.7 Effect of pH on relative activity of protease

圖8 防污蛋白酶的儲存穩(wěn)定性Fig.8 The storage stability of free and immobilized protease

2.4 固定化蛋白酶防污性能評價

2.4.1固定化蛋白酶對底棲硅藻附著與脫除性能的影響 本文采用載酶量約22 mg/g NPSiO2的固定化蛋白酶試樣完成底棲硅藻附著實驗，固定化蛋白酶質(zhì)量百分?jǐn)?shù)約為2.2%。底棲硅藻在空白丙烯酸樹脂樣片和表面黏附固定化酶樣片表面的附著情況如圖9所示，底棲硅藻在固定化酶樣片表面的附著數(shù)量顯著低于空白樣片表面。

如圖10所示，空白丙烯酸樹脂樣片表面底棲硅藻平均附著密度達(dá)到1 237 個/mm2，而在黏附固定化酶樣片表面密度僅為286 個/mm2，抑制率達(dá)到76.8%。經(jīng)1.5 m/s的水流沖刷后，空白丙烯酸樹脂樣片表面底棲硅藻的脫除率約為54.4%，黏附固定化酶樣片表面底棲硅藻的脫除率約為79.3%。相同流速下，黏附固定化酶樣片表面底棲硅藻的脫除率較高，表明底棲硅藻的含酶表面的附著強(qiáng)度較低，蛋白酶影響了底棲硅藻的附著行為，體現(xiàn)出較好的抑制硅藻附著的性能。

圖9 底棲硅藻在空白丙烯酸樹脂樣片a和表面黏附固定化酶樣片b表面的附著照片F(xiàn)ig.9 Images of diatom attachment on the surfaces of acrylic resin a and immobilized protease b

圖10 水流沖刷測試前后底棲硅藻附著密度Fig.10 The density of diatom before and after water scouring

2.4.2 固定化蛋白酶對貽貝足絲附著性能的影響 貽貝足絲附著實驗如圖11所示，經(jīng)統(tǒng)計對照空白涂層表面貽貝足絲平均附著數(shù)量約為11條左右，而含酶涂層表面貽貝足絲平均附著數(shù)量僅有2.5條左右，足絲附著抑制率可達(dá)77.3%?？梢钥闯觯迪犜淳戤a(chǎn)出蛋白酶對貽貝足絲附著具有較明顯的抑制作用。

(a.附著前 Before settlement；b.附著后 After settlement.)圖11 NPSiO2固定化酶對貽貝足絲附著的影響Fig.11 Effect of immobilized protease on the settlement of mussels

3 結(jié)語

本文采用反相乳液聚合法制備了NPSiO2，確定了NPSiO2氨基化所需APTES適當(dāng)加入量和共價固定牡蠣源菌株產(chǎn)出蛋白酶所需戊二醛濃度，并通過底棲硅藻和貽貝足絲附著實驗評價了固定化蛋白酶的防污性能。實驗表明，當(dāng)APTES與NPSiO2重量比達(dá)到0.4、戊二醛濃度為1.5%時，可較好地完成蛋白酶在所制備NPSiO2表面的固定化。相對于游離酶，固定化蛋白酶對溫度、pH值耐受性顯著提高，儲存50天后固定化酶活力為游離酶的3倍，儲存穩(wěn)定性良好。另外，固定化蛋白酶對硅藻附著的抑制率達(dá)到76.8%，并可顯著降低硅藻附著強(qiáng)度，對貽貝足絲附著抑制率也達(dá)到了70%以上。與傳統(tǒng)防污劑相比，酶具有突出的環(huán)境友好性和高效的防污活性，通過固定化處理可顯著提升其應(yīng)用性能[27-29]，因此，固定化蛋白酶對發(fā)展新型防污涂層材料與技術(shù)具有積極的意義。