馬培振，張 哲，于瑞海，王昭萍**，李鵬飛

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)，山東 青島 266003；2.萊州市長漁水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 261415)

海灣扇貝(Argopectenirradiansirradians)原產(chǎn)于北美洲大西洋西岸，于1980年代初被引入我國[1]，后發(fā)展成為主要扇貝養(yǎng)殖品種之一，引領(lǐng)第三次海水養(yǎng)殖浪潮[2]。受長期近交影響，海灣扇貝體現(xiàn)出明顯的種質(zhì)退化、抗病能力減弱、規(guī)格減小等不足[3-4]，開展雜交育種、三倍體育種和種質(zhì)提純復壯[4-7]等遺傳改良工作成為大勢所趨。隨著種間及遠緣雜交的進行，如何保存海灣扇貝優(yōu)良種質(zhì)、避免種質(zhì)混亂以及可能引起的種質(zhì)衰退成為國內(nèi)水產(chǎn)界和科研界亟需解決的難題。

精子超低溫冷凍保存技術(shù)研究自20世紀中葉開始以來，在陸地動物、淡水及海水魚類、海洋貝類等方面均取得較大進展[8-11]。主要冷凍流程包括精子獲取、稀釋液選取、抗凍保護劑選取、精液稀釋或濃縮、降溫、解凍、凍精質(zhì)量評估等，其中，研究多集中于稀釋液和抗凍保護劑的選擇、降溫和解凍方式，以及精子質(zhì)量評估等[11,15,20]。在海洋貝類中，又以牡蠣的精子冷凍保存研究為多[9，12-14]，扇貝相對較少，僅見于蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)[15-16]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[15,17]、紫扇貝(A.purpuratus)[18]等經(jīng)濟品種，而未有海灣扇貝精子超低溫冷凍保存及應用相關(guān)報導。精子超低溫冷凍技術(shù)可以使不同自然繁殖時期和地域的生物，利用凍精的保存或運輸進行近緣或遠緣雜交，突破季節(jié)限制，避免親本運輸，同時避免引種過程中可能帶入的其他微生物，可推動貝類的種質(zhì)和遺傳多樣性保護，在遺傳性狀改良等方面具有極高的應用價值。本研究采用傳統(tǒng)分步降溫法，對海灣扇貝精子超低溫冷凍保存技術(shù)進行探討，以期掌握海灣扇貝精子超低溫冷凍技術(shù)流程與要點，對于海灣扇貝種質(zhì)資源保存、跨季跨域雜交等研究有指導價值。

1 材料與方法

1.1 材料

海灣扇貝為萊州市長漁水產(chǎn)有限公司蓄養(yǎng)至性腺成熟的一齡親貝，分別采用自然排放法與人工解剖取精法獲取精液。自然排放在盛有潔凈升溫(23℃)海水的1L燒杯中進行；解剖取精時，首先將扇貝兩殼打開，將精巢外表擦拭干凈，然后用消毒后的解剖剪剖開精巢表皮，剪取潔凈的精塊置于少量海水中，攪拌使精子活化并散開。

超低溫冷凍保存裝置選用YDS-30-125型液氮罐。

1.2 抗凍保護液配制

分別使用二甲基亞砜(DMSO)和甘油(GLY)作為抗凍保護劑。以過濾后升溫(23℃)海水為基礎(chǔ)稀釋液，分別配制濃度為5%、10%、15%、20%和25%的DMSO和2%、4%、6%、8%、10%的GLY，以及5% DMSO和5% GLY的混合溶液作為抗凍保護液。

1.3 精液稀釋與分裝

分別以抗凍液與精液體積比為1∶1、2∶1、3∶1對精液進行稀釋，總體積控制在0.5～1 mL，保存于1.8 mL凍存管中，混勻后，固定墜子，置于4℃平衡5 min。

1.4 降溫及投氮保存

測定液氮面深度。體系經(jīng)平衡后，分別按以下程序進行降溫后，投入液氮保存。Ⅰ組：液氮罐罐口處和液氮面上方10 cm處分別停留10 min；Ⅱ組：液氮面上方10 cm處停留5 min；Ⅲ組：液氮面上方20 cm、3 cm處分別停留5 min。

1.5 凍精解凍及質(zhì)量檢測

精液凍存后，分別于20、25、30和35℃的水浴環(huán)境中解凍。解凍后，顯微鏡下采用區(qū)域觀察法統(tǒng)計精子運動狀態(tài)，以活化(晃動和游動)精子的百分比評價凍精質(zhì)量和冷凍效果。分別冷凍1、15和30 d后，取最佳冷凍效果下的解凍精子與蝦夷扇貝自然產(chǎn)卵子人工授精，觀察胚胎發(fā)育狀況，統(tǒng)計受精率、卵裂率和孵化率。

2 結(jié)果

2.1 精子收集方式對冷凍效果的影響

分別采用自然排精和解剖取精的方法收集精液，與20%DMSO以體積比1∶2混合，經(jīng)Ⅱ組降溫冷凍1d并30℃水浴解凍后，所得精液活力及冷凍后效果見圖1。結(jié)果顯示，2種方式獲得的精子，在冷凍前活力均較高，差異不顯著(P>0.05)；解凍后，自然排放組精子活力為9.0%±3.6%，明顯低于解剖取精組(49.3%±7.4%)(P<0.05)。

2.2 抗凍液

解剖取精，與不同的抗凍保護劑以體積比1∶2混合，經(jīng)Ⅱ組降溫冷凍1 d并30℃水浴解凍后，冷凍結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，不同的抗凍保護劑對精子冷凍效果的影響有差異。使用DMSO作為抗凍劑，對精子冷凍的保護效果最好，當DMSO濃度為20%時，精子活力最高，達到79.0%；使用GLY作為抗凍劑，精子冷凍效果較差，精子活力最高僅為29.3%，與DMSO的最佳保護效果差異顯著(P<0.05)。當DMSO和GLY各5%混合使用作為抗凍保護液時，精子活力達到32.3%，顯著優(yōu)于僅使用GLY作為抗凍保護劑的冷凍效果(P<0.05)。

圖1 收集方式對精子冷凍效果的影響Fig.1 Effect of collecting methods on sperm cryopreservation

圖2 抗凍保護劑對精子冷凍效果的影響Fig.2 Effect of cryoprotectant agent(CPA) on sperm cryopreservation

2.3 精液稀釋

解剖取精，與20%DMSO以不同體積比稀釋混合，經(jīng)Ⅱ組降溫冷凍1 d并30℃水浴解凍，精子冷凍效果見圖3。當體積比為2∶1和3∶1時，冷凍效果均好，精子活力分別達到75.7%±6.0%和71.7%±7.6%，差異不顯著(P>0.05)；1∶1時，冷凍效果最差，為50.7%。

2.4 降溫程序

解剖取精，與20%DMSO以體積比1∶2混合，使用3個不同降溫程序，冷凍1d并30℃水浴解凍后，精子冷凍效果見表1，3組差異顯著(P<0.05)。當精液在液氮面上10 cm處停留5 min后投入液氮，精子活力最高，達到69.4%±5.3%；精子在液氮罐罐口處(液氮面距罐口25 cm)和液氮面上方10 cm處分別停留10 min，再投入液氮，凍精活力最差，且標準偏差較大，結(jié)果不穩(wěn)定，平均為31.5%；精子在液氮面20和3 cm處分別停留5 min后投入液氮，精子活力能夠達到55.0%±6.6%。

圖3 精液稀釋比例對精子冷凍效果的影響Fig.3 Effect of dilution ratio of sperm on cryopreservation

表1 降溫程序?qū)永鋬鲂Ч挠绊慣able 1 Effect of freezing steps on sperm cryopreservation

2.5 解凍水浴溫度

解剖取精，與20%DMSO以體積比1∶2混合，經(jīng)Ⅱ組降溫冷凍1 d后，凍精在4種水浴溫度下解凍，所得精子活力情況見圖4。當水浴溫度為30℃時，所得精子活力最高，達到80.7%±7.6%；水浴溫度為25℃時，精子活力也較高，為77.0%±7.5%，與水浴溫度為30℃時差別不顯著(P>0.05)；水浴溫度為20℃時，精子活力最低，僅為30.3%±5.0%。

2.6 活力檢測

以解剖的方式獲取海灣扇貝精子，用濃度20%的DMSO作為抗凍保護劑，與精液以2∶1均勻混合，總體積不超過1 mL。4℃平衡5 min后，于液氮面以上10 cm穩(wěn)定5 min，投入液氮冷凍保存。解凍時，于30℃水浴中搖動融化。此方案得到的冷凍后海灣扇貝精子活力最高，晃動和游動精子比例達到86.0%。將海灣扇貝精子與蝦夷扇貝卵子進行人工授精，受精和孵化情況見表2。

圖4 水浴溫度對凍精解凍效果的影響Fig.4 Effect of thawing temperature on sperm cryopreservation

表2 海灣扇貝凍精對蝦夷扇貝卵子受精孵化的影響Table 2 Results of crossing fertilization by cryopreserved sperm of A.i.irradians

結(jié)果顯示，無論是解剖精子還是解凍精子均可以使蝦夷扇貝卵子受精并孵化。海灣扇貝凍精進行雜交的受精率、卵裂率、孵化率均明顯低于對照組(P<0.05)；冷凍保存1、15和30 d后的精子在活力、受精率、卵裂率和孵化率方面均差異顯著(P<0.05)，未呈現(xiàn)規(guī)律性。

3 討論

海洋貝類精子超低溫冷凍一般使用分步降溫法或程序降溫法進行，其中程序降溫法借助于程序降溫儀，基于電腦程序，按照預設(shè)的程序進行降溫，對于降溫操控較為精確；而分步降溫法則具有操作簡便、設(shè)備要求低[19]等優(yōu)點，保存效果良好[9]，因此應用更為廣泛。本研究使用分步降溫法，對海灣扇貝精子冷凍技術(shù)流程進行探究，完善扇貝精子超低溫冷凍保存技術(shù)。

貝類精子質(zhì)量取決于親貝種質(zhì)和性腺發(fā)育程度，同時受外界環(huán)境等因素的影響。獲取高質(zhì)量、高數(shù)量的精子是冷凍操作成功的前提。常規(guī)精子冷凍方案不適用于稀少精子冷凍[27]，而質(zhì)量較差、活力弱的精子在冷凍和復蘇過程中更易導致精子核DNA損傷，影響凍存后生理功能[28]。解剖取精方式在牡蠣[12-14,20-21]、珍珠貝[22-23]等貝類的精子超低溫冷凍中應用廣泛，而扇貝中主要以自然排放的方式獲取精液[15-17]。然而，自然排放的精液易受排泄物、組織粘液等污染，同時精子濃度較小、濃縮困難[24]，對精子冷凍保存效果造成影響。本研究發(fā)現(xiàn)，對海灣扇貝性腺成熟個體解剖取精，精子濃度高、活力良好，且解凍后精子活力優(yōu)于自然排放后的凍存精子，這可能是由于研究中自然排放的精子濃度較低、精子長時間激活而能量損耗嚴重等原因?qū)е碌腫14,16,27]。

精子在超低溫冷凍過程中，胞內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧和大冰晶易對精子核DNA、膜結(jié)構(gòu)以及頂體酶活性造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷[28-29]?？箖霰Ｗo劑能夠控制水分滲透速度從而穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)[30]，并且能夠保護精子DNA免受損傷[28]。因此，選擇合適的抗凍保護劑和稀釋液是精子冷凍保存成敗的關(guān)鍵[29]。DMSO作為最常用的滲透性抗凍保護劑，在很多物種的精子冷凍操作中最適濃度相差不大[9,31]。研究發(fā)現(xiàn)，在以分步降溫法進行扇貝精子超低溫冷凍的實驗中(見表3)[15-16]，DMSO均為最佳的抗凍保護劑，終濃度范圍均為10%～20%，體現(xiàn)出DMSO在不同扇貝中適用的普遍性。GLY對精子凍存有一定保護作用，且作用濃度較低，但單一使用時效果不佳，可用作抗凍添加劑，與DMSO共同使用以增強保護效果，這與丁兆坤[31]的結(jié)果一致。

表3 不同扇貝分步降溫法精子超低溫冷凍的比較Table 3 Comparison of sperm cryopreservation by freezing by steps among different scallops

注:降溫程序*: 為于液氮面上方一定距離停留的時間。
Note: Distance above liquid nitrogen surface are shown here with time marked in brackets.

降溫速度影響精子細胞內(nèi)水分的滲出速率，選擇合理的降溫程序，可以控制胞內(nèi)冰晶形成與滲透壓升高的平衡，將精子的損傷降至最低水平[9,17]。分步降溫法即通過控制樣品在液氮面上方的高度和時間，從而控制降溫速度，并最終轉(zhuǎn)入液氮保存。該法雖不能獲取確切的降溫參數(shù)，但可大批量凍存精子，冷凍效果較好。本研究中，當海灣扇貝精液在液氮面上10 cm處停留5 min后投入液氮，精子活力最高。研究發(fā)現(xiàn)，凍存體系的解凍速率也會影響精子活力。不同扇貝精子解凍的最適水浴溫度有差異(見表3)，但尚未有解凍水浴溫度與物種生物學相關(guān)性的研究[9]。

凍精質(zhì)量檢測的常用方法有活動精子比率、受精率、精子結(jié)構(gòu)檢測等[9]，本研究中綜合活動精子比率和受精率來判定凍精質(zhì)量。海灣扇貝為雌雄同體，采用過濾或淡水消毒法等難以收集到未受精的純凈卵子，而解剖獲得的卵子在生理上不成熟，不能直接受精或者受精率極低[26]，因此本研究選擇工廠化育苗過程中與海灣扇貝苗種生產(chǎn)季節(jié)有一定時間重合的蝦夷扇貝自然排放的卵子與海灣扇貝凍精進行授精以評估凍精質(zhì)量，該方法簡單、可行，效果良好。然而，由于兩者配子兼容性有限，蝦夷扇貝卵子與海灣扇貝正常精子雜交的受精率、卵裂率、孵化率均較低[32]，而使用海灣扇貝凍精時受精率、卵裂率、孵化率更低，體現(xiàn)出冷凍操作對精子結(jié)構(gòu)或能量的損傷作用。

精子冷凍保存作為種質(zhì)資源保護的重要手段，在陸生動物和海洋動物中均有十分重要的科研和實際應用價值[9, 12]。本研究發(fā)現(xiàn)，海灣扇貝凍精復蘇后的生理功能和活力與保存時間沒有顯著關(guān)聯(lián)，證實了液氮超低溫保存的穩(wěn)定性以及分步降溫法進行精子冷凍以長期保存的可行性，對于生物精子庫的建立和完善具有較大的推動作用。

4 結(jié)語

本文采用分步降溫法對海灣扇貝解剖精子進行超低溫冷凍保存，開發(fā)冷凍方法和流程。以升溫的自然海水(23 ℃)為基礎(chǔ)稀釋液，以終濃度13.3%的二甲基亞砜為抗凍保護劑，體系經(jīng)4℃平衡和液氮面以上10 cm穩(wěn)定5 min后，投入液氮冷凍，可長期保存。解凍時，于30 ℃水浴中搖動融化。此方案對海灣扇貝精子超低溫冷凍保存效果最好，可得到具有良好活力和生理功能的精子。使用蝦夷扇貝卵子檢驗海灣扇貝精子超低溫冷凍保存效果，方法簡單、可行。本研究為海灣扇貝種質(zhì)資源保存、跨季雜交育種等實踐活動提供了參考。但是，扇貝精子超低溫冷凍領(lǐng)域研究較少，品種偏少、技術(shù)流程尚不完善，如何優(yōu)化冷凍流程以獲得更高活力和生理功能的凍精，從而發(fā)揮海洋貝類精子庫的作用、解決實踐應用等問題仍是當前種質(zhì)資源保護的主要難題。