李玉強(qiáng)，王睿甲，李語麗**，孫紅振，李仰平，牟 闖，呂 佳，王 師,2，包振民,3

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2.海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3.海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

棘皮動物在生物進(jìn)化史上占有獨(dú)特的地位，它們是無脊椎動物中進(jìn)化地位最高的門類，同時(shí)也是后口動物中最為古老的種類[1]。仿刺參作為棘皮動物的代表性物種，具有極其重要的研究價(jià)值。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，其因營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值高，已經(jīng)成為了中國、日本、韓國和俄羅斯等地最具價(jià)值的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)物種之一[2]；在生物學(xué)方面，其夏眠和組織再生的生物學(xué)特性已經(jīng)逐漸成為研究熱點(diǎn)[3]，仿刺參也逐漸成為無脊椎動物中重要的研究物種。鑒于仿刺參在經(jīng)濟(jì)上以及生物學(xué)研究上越來越重要的研究價(jià)值，在基因組和轉(zhuǎn)錄組水平上對其進(jìn)行生物學(xué)深度分析，已經(jīng)成為仿刺參研究的重要任務(wù)。近年來，由于RNA-seq技術(shù)的廣泛應(yīng)用，仿刺參在轉(zhuǎn)錄組水平上的研究也有了較大的進(jìn)展，然而DNA甲基化作為重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，在仿刺參中的研究仍然比較匱乏，趙業(yè)等曾用同裂酶酶切檢測過仿刺參非夏眠狀態(tài)下組織的DNA甲基化狀況[4]，但是組織中各基因的DNA甲基化的詳細(xì)信息并不完善。

DNA甲基化是DNA分子層面表觀修飾的重要方式。在真核生物中，DNA甲基化參與了多種生物體內(nèi)的生理生化過程，具有重要的生物學(xué)功能，包括維持胚胎的正常發(fā)育[5-6]；使X染色體失活[7]，失活的X染色體上大部分基因的CpG是甲基化的，而在活化的染色體上是非甲基化的[8]；維持染色體穩(wěn)定性：DNA甲基化被證明與轉(zhuǎn)座子活性相關(guān)，在哺乳動物中轉(zhuǎn)座子相關(guān)的DNA序列均呈現(xiàn)出高度甲基化的狀態(tài)，同時(shí)保持轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)[9]。隨著DNA甲基化成為表觀遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)，其相關(guān)生物學(xué)特性也被廣泛研究。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，全基因DNA甲基化的檢測方法也不斷推陳出新，MethylRAD-Seq技術(shù)結(jié)合了甲基化修飾依賴性內(nèi)切酶和簡化基因組限制性酶切分型技術(shù)的特點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)在于可以在不知道基因組背景信息的前提下大規(guī)模檢測全基因組范圍內(nèi)的甲基化位點(diǎn)，而且該技術(shù)建庫流程簡單、技術(shù)重復(fù)性好、假陽性率低[6]。

相關(guān)研究表明，無脊椎動物基因組甲基化水平通常低于脊椎動物[10]，而且甲基化標(biāo)記更趨向于出現(xiàn)在基因功能區(qū)而不是基因間區(qū)[11]，也暗示了無脊椎動物甲基化規(guī)律與脊椎動物有所差異。基于生物體各組織的甲基化狀態(tài)有所差異，本論文選擇了3種仿刺參研究常用且重要的組織(腸道、呼吸樹和性腺常出現(xiàn)于仿刺參研究中，而且其萎縮退化和再生特性是仿刺參夏眠、再生等研究的理想材料)進(jìn)行后續(xù)研究，通過建立仿刺參3種組織的甲基化文庫，利用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)拼接完成的部分仿刺參基因組數(shù)據(jù)和表達(dá)譜數(shù)據(jù)(未發(fā)表，表達(dá)譜數(shù)據(jù)與本研究中的甲基化數(shù)據(jù)來源于同一批但非同一個(gè)體的組織材料)初步探究仿刺參組織甲基化狀況及其特異性，為豐富仿刺參甲基化研究內(nèi)容和無脊椎動物的甲基化發(fā)生規(guī)律提供可用信息。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究選用的仿刺參來源于遼寧省大連市獐子島黑石礁海區(qū)(124°47′E, 39°3′N)，組織為成體仿刺參正常狀態(tài)下的腸道、呼吸樹和性腺三種組織。材料取出后立即用PBS沖洗去除材料表面海水以及其他雜質(zhì)，然后用RNAwait浸泡保存于1.5 mL EP管中，帶回實(shí)驗(yàn)室后用吸管將RNAwait吸取干凈，置于-80℃冰箱長期保存，用于后續(xù)DNA提取和甲基化文庫的構(gòu)建。

1.2 Methy RAD-Seq測序文庫的構(gòu)建

首先，采用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提法提取仿刺參基因組DNA，其中裂解液更換為CTAB(Tris-HCl 1 mol/L，pH=8.0；EDTA 0.5 mol/L )，DNA 的質(zhì)量用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測；其次，參照Wang等[12]MethylRAD文庫構(gòu)建方法，應(yīng)用MspJ Ⅰ內(nèi)切酶進(jìn)行組織甲基化文庫構(gòu)建(見圖1)[6]，構(gòu)建過程如下：

圖1 MspJ Ⅰ酶切位點(diǎn)[13]Fig.1 Recognition site of MspJ Ⅰ[13]

(1) MspJ Ⅰ酶切基因組DNA：

MspJ Ⅰ內(nèi)切酶：MspJ Ⅰ是一種識別甲基化位點(diǎn)的核酸內(nèi)切酶，它有特定的識別位點(diǎn)，并在該識別位點(diǎn)兩側(cè)進(jìn)行酶切，得到一個(gè)36 bp的酶切片段。MspJ Ⅰ識別位點(diǎn)見圖1。

首先將事先提取的高質(zhì)量基因組DNA進(jìn)行濃度稀釋，將濃度控制在100 ng/μL，然后將DNA樣品輕彈混勻，配置如下酶切體系：

DNA sample1 μL(100 ng/μL)MspJI1 μLBSA0.15 μLBuffer41.5 μLEnzyme4.5 μLddH2O7.85 μL

酶切條件：37 ℃酶切4 h。

(2)酶切標(biāo)簽連接接頭：

以第一步酶切產(chǎn)物為底物，每個(gè)DNA樣品配置如下反應(yīng)體系：

酶切產(chǎn)物10 μLT4 ligase1 μLT4 buffer2.2 μLMspJ Ⅰ adaptorⅠ 1 μL(5 μmol/L)MspJ Ⅱ adaptor Ⅱ 1 μL(5 μmol/L)ATP2 μL(10 mmol/L)ddH2O4.8 μL

連接條件：4 ℃連接16 h。

(3)一輪PCR富集MSPJ Ⅰ酶切標(biāo)簽：

反應(yīng)體系為:連接產(chǎn)物14 μLdNTP4.8 μL(2.5 μmol/L)phusion0.4 μL5xHF buffer8 μL1stprimer 10.8 μL(10 μmol/L)1stprimer 20.8 μL(10 μmol/L)ddH2O11.2 μL

反應(yīng)條件：98 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，進(jìn)行14～18個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

(4)二輪PCR引入Barcode序列：

模板6 μLdNTP4.8 μL(2.5 μmol/L)2nd Primer0.4 μL(10 μmol/L)Barcode0.4 μL(2 μmol/L)5xHFbuffer8 μLPhusion0.4 μLddH2O20 μL

反應(yīng)條件：98 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，進(jìn)行5～7個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

(5)PCR產(chǎn)物純化回收

使用QIAGEN PCRPurification Kit回收純化PCR產(chǎn)物。

最后用Qubit測定純化后樣品濃度，按照每個(gè)文庫DNA總量相等的原則，將文庫等量混樣，使用Illumina Hiseq2000平臺進(jìn)行Single end 50 bp測序。

試劑：

MspJ Ⅰ(New EngLandBioLabs，產(chǎn)品型號R0661L)

T4 DNA Ligase(New EngLandBioLabs，產(chǎn)品型號M0202L)

Phusion(New EngLandBioLabs，產(chǎn)品型號M0535L)

QIAGEN PCR Purification Kit(Qiagen，產(chǎn)品型號28106.0)

Qubit 2.0 fluorometer(Invitrogen，產(chǎn)品型號Q32866)

1.3 測序數(shù)據(jù)處理及分析

1.3.1 測序數(shù)據(jù)處理 由于仿刺參基因組未完全拼接完成，大部分scaffold長度較短，所以本研究從已拼接的基因組中篩選出最長的1 000條scaffold作為參照基因組進(jìn)行后續(xù)分析。

數(shù)據(jù)質(zhì)量控制：測序數(shù)據(jù)為單端50 bp的reads，為保證數(shù)據(jù)質(zhì)量，首先對測序得到的fastq格式的文件處理，進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾。質(zhì)量過濾的條件為：(1)首先截取reads的前30 bp作為有效序列；(2)過濾掉含有總長度10%數(shù)量的N(不確定的堿基)的測序reads；(3)過濾掉含有總長度20%數(shù)量的低質(zhì)量(質(zhì)量值低于10)堿基的reads；(4)過濾掉含有超過10個(gè)連續(xù)堿基的reads；(5)統(tǒng)計(jì)測序得到的總的reads量、每個(gè)文庫的數(shù)據(jù)量，以及經(jīng)過質(zhì)量控制后的數(shù)據(jù)量，以檢測文庫的質(zhì)量。

甲基化標(biāo)簽在仿刺參基因組上的分布：首先從仿刺參參照基因組中提取含有CG二核苷酸、長度為30 bp和含有CHG三核苷酸、長度為29 bp的序列，使用soap軟件[14-15]，將高質(zhì)量標(biāo)簽與基因組提取的標(biāo)簽進(jìn)行唯一比對，統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)的甲基化標(biāo)簽深度，以reads深度代表位點(diǎn)的甲基化水平。分別統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣本在不同位點(diǎn)處的甲基化水平，若樣本的某個(gè)標(biāo)簽在檢測深度大于5，則認(rèn)為此樣本的該位點(diǎn)發(fā)生了甲基化。

計(jì)算甲基化頻率可以反映基因組的總體甲基化水平，甲基化頻率是指平均出現(xiàn)一個(gè)甲基化位點(diǎn)的堿基數(shù)目，即相應(yīng)區(qū)域長度/該區(qū)域內(nèi)甲基化標(biāo)簽數(shù)目，計(jì)算公式為相應(yīng)區(qū)域總長度÷該區(qū)域內(nèi)甲基化標(biāo)簽數(shù)量。

1.3.2 不同組織基因甲基化水平差異性分析 參照RPKM計(jì)算方式，將基因甲基化水平計(jì)算公式定義為：total methylated tags/(mapped reads(millions)×gene lenth(kb))。計(jì)算并統(tǒng)計(jì)出各組織中基因的甲基化水平。

在各組織基因甲基化水平已知的基礎(chǔ)上，利用R軟件包中的“edgeR”函數(shù)分別進(jìn)行兩種組織之間基因甲基化水平的差異分析，然后將3組差異分析中的差異基因(p<0.05為篩選閾值)匯總進(jìn)行Gene Ontology(GO)功能富集分析，從而更好地了解各組織之間甲基化水平差異基因所涉及的相關(guān)生物學(xué)過程。

1.3.3 基因甲基化水平與表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析 基因甲基化位點(diǎn)發(fā)生位置不同，對基因表達(dá)調(diào)控的作用也有所區(qū)別[16]。在脊椎動物中，通常啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化伴隨著基因轉(zhuǎn)錄沉默或轉(zhuǎn)錄抑制[16-17]，與此相比，無脊椎動物中DNA甲基化規(guī)律與調(diào)控機(jī)制不同。為了更好的了解仿刺參組織中甲基化位點(diǎn)在啟動子與基因功能區(qū)對基因表達(dá)調(diào)控之間的相關(guān)性，本研究通過整合已有的甲基化文庫數(shù)據(jù)與仿刺參表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對各部分基因進(jìn)行了分析。首先，在獲得參照基因組基因相關(guān)的甲基化標(biāo)簽位置信息的基礎(chǔ)上，將基因分為以下3部分：只在啟動子區(qū)域有甲基化標(biāo)簽分布的基因、只在基因功能區(qū)有甲基化標(biāo)簽分布的基因以及在啟動子區(qū)域和基因功能區(qū)均有甲基化標(biāo)簽分布的基因；其次，分別繪制各組織所有基因以及各部分基因甲基化水平與表達(dá)量之間的相關(guān)性散點(diǎn)圖，進(jìn)而使用R軟件包中的“cor.test”函數(shù)進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)(method=“pearson”)分析基因甲基化水平與表達(dá)水平之間的相關(guān)性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 仿刺參組織的MethylRAD文庫數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及甲基化位點(diǎn)鑒定

對已經(jīng)拼接完成的仿刺參最長的前1 000條scaffold中的MspJ Ⅰ酶酶切位點(diǎn)通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行電子酶切分析，數(shù)據(jù)顯示總共有4 234 227個(gè)酶切位點(diǎn)，CG和CHG型各占1 699 838和2 534 389個(gè)，當(dāng)酶切位點(diǎn)中H=C時(shí)，甲基化標(biāo)簽為CCG型，為方便統(tǒng)計(jì)分析，本研究后續(xù)分析將此類標(biāo)簽歸為CG型。測序結(jié)果顯示，3個(gè)樣本總共獲得77 505 862條reads，其中高質(zhì)量reads有77 432 392條，占總reads的99.9%以上，前1 000條scaffold上總唯一比對reads數(shù)為6 598 460條，具體信息見表1。對3種組織樣本的酶切標(biāo)簽進(jìn)行甲基化位點(diǎn)進(jìn)行鑒定分析，其中CG型甲基化位點(diǎn)比例明顯高于CHG型甲基化位點(diǎn)，且不同組織中各甲基化位點(diǎn)類型所占比例表現(xiàn)出高度一致性。腸道、呼吸樹和性腺3種組織檢測到的甲基化位點(diǎn)數(shù)分別為114 417、128 251和136 423，其中檢測深度大于5的位點(diǎn)數(shù)分別為45 202、52 288和56 786，各組織的甲基化位點(diǎn)類型見表2。圖2所示的是3種組織中甲基化位點(diǎn)分型比例，從圖中可以清晰的看出CG型甲基化位點(diǎn)占甲基化位點(diǎn)的主要部分，約91%(其中CCG類型約為8.6%)，而CHG型只占9%左右，2種類型的標(biāo)簽比例與電子酶切結(jié)果相反。

表1 MethylRAD文庫測序原始數(shù)據(jù)Table 1 The primary data of MethylRAD libraries

Note: Int.：腸道；Res.:呼吸樹；Gon.：性腺。Int Res and Gon represent intestine,respiratory trees and gonad respectively.

表2 甲基化位點(diǎn)數(shù)目及類型統(tǒng)計(jì)Table 2 Number and type statistics of methylation sites

Note: Int.：腸道；Res.:呼吸樹；Gon.：性腺。Int Res and Gon represent intestime,respiratory trees and gonad respectively.

圖2 CG和CHG型甲基化位點(diǎn)比例Fig.2 Percentage of methylation sites of CG and CHG

2.2 仿刺參組織中甲基化位點(diǎn)的分布特征分析

利用仿刺參參照基因組，將MethylRAD文庫測序中檢測到的MspJ Ⅰ甲基化標(biāo)簽定位到基因區(qū)及非基因區(qū)。甲基化標(biāo)簽在基因的啟動子區(qū)(promoter)(轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2k的范圍)，UTR區(qū)，CDS區(qū)，內(nèi)含子區(qū)(intron)以及在非基因區(qū)的基因間區(qū)(intergenic)均有分布。甲基化標(biāo)簽分布結(jié)果(見表3)顯示：腸道、呼吸樹和性腺3種組織的甲基化標(biāo)簽均有較大比例分布于基因間區(qū)，位點(diǎn)數(shù)目分別為20 176(44.64%)、23 409(44.77%)和26 076(45.92%)；CDS區(qū)域略低于內(nèi)含子區(qū)，位點(diǎn)數(shù)目為10 135(22.42%)、11 515(22.02%)和11 573(20.38%)，內(nèi)含子區(qū)域位點(diǎn)數(shù)目分別為12 494(27.64%)、14 646(28.01%)和16 059(28.28%)；啟動子區(qū)域位點(diǎn)數(shù)目分別為2 022(4.47%)、2 298(4.39)和2 572(4.53%)；占比最小的區(qū)域?yàn)閁TR區(qū)，為375(0.83%)、420(0.80%)和506(0.89%)。對2種不同類型的甲基化標(biāo)簽分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。從表3中可以看出3種組織的2種甲基化位點(diǎn)分布狀況具有很高的一致性，不同類型的甲基化位點(diǎn)在不同區(qū)域的分布比例略有差別。CG型甲基化位點(diǎn)在基因間區(qū)的分布比例明顯高于其它區(qū)域，CDS區(qū)域所占比例低于內(nèi)含子區(qū)域；而CHG型甲基化位點(diǎn)在基因間區(qū)的分布比例相對較低，在基因功能區(qū)與CG型位點(diǎn)分布不同，CHG型在CDS區(qū)的占比要高于內(nèi)含子區(qū)域。

表3 甲基化標(biāo)簽在不同區(qū)域的分布Table 3 Distribution of methylation tags in different region

為了深入了解仿刺參甲基化位點(diǎn)的分布特征，我們通過統(tǒng)計(jì)基因間區(qū)和基因功能區(qū)各區(qū)域的長度，分別計(jì)算得到各組織甲基化標(biāo)簽在不同區(qū)域的標(biāo)簽頻率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果(見表4)顯示3種組織在各區(qū)域的標(biāo)簽密度趨勢一致性較高。CDS區(qū)域標(biāo)簽密度明顯大于其它區(qū)域，分別為1 447堿基、1 273堿基和1267堿基；標(biāo)簽密度最小的區(qū)域?yàn)榛蜷g區(qū)和5’UTR區(qū)域，分別是11 748堿基、10 144堿基、9 103堿基和7 722堿基、6 499堿基、5 416堿基，低于已報(bào)道的其他無脊椎動物[18]。

表4 甲基化標(biāo)簽在不同區(qū)域的頻率Table 4 Frequency of methylation tags in different region

2.3 不同組織甲基化基因的差異分析

3種組織之間在甲基化位點(diǎn)及分布特征上存在較高的一致性，但是各組織也存在其本身的特異性。3種組織甲基化基因韋恩圖(見圖3)顯示：各組織均有其本身的特異甲基化基因，其中呼吸樹組織特異甲基化基因最多，有387個(gè)，腸道組織特異甲基化最少，有55個(gè)，性腺組織有216個(gè)。利用R軟件包中“edgeR”函數(shù)對3個(gè)組織的甲基化基因進(jìn)行差異分析，篩選(p<0.05為閾值)出各組織之間的差異基因(見圖4)，結(jié)果顯示呼吸樹組織和性腺組織之間甲基化水平差異基因最多，為1 483個(gè)，腸道組織與性腺組織之間甲基化水平差異基因最少，有669個(gè)。對3種組織甲基化水平差異基因進(jìn)行功能富集分析，分析結(jié)果(見表5)顯示組織間甲基化水平差異基因涉及到多種重要的生物學(xué)過程，包括生物體繁殖、脅迫應(yīng)對機(jī)制、大分子合成及物質(zhì)代謝、能量代謝等重要生命活動相關(guān)生物過程。

圖3 三種組織甲基化基因分析Fig.3 Analysis of methylated gene in three tissues

圖4 三種組織甲基化基因差異分析結(jié)果Fig.4 Analysis of differentially methylated genes in three tissues

表5 三種組織甲基化水平差異基因GO富集分析Table 5 GO enrichment of differently methylated genes in three tissues

2.4 仿刺參組織基因甲基化水平與表達(dá)水平之間的相關(guān)性分析

圖5～7所示是3種組織中有甲基化修飾基因的甲基化水平與表達(dá)水平的相關(guān)性。脊椎動物甲基化位點(diǎn)主要分布基因間區(qū)，啟動子區(qū)域發(fā)生DNA甲基化對基因表達(dá)主要起抑制作用[18]。為了驗(yàn)證仿刺參組織中DNA甲基化是否符合這一規(guī)律，我們分別調(diào)查了仿刺參3個(gè)組織3類甲基化基因(如1.3所述分類)及全部甲基化基因的甲基化水平與基因表達(dá)水平的相關(guān)性。從圖中可以看出，與脊椎動物不同，仿刺參3種組織所有甲基化基因的甲基化水平與表達(dá)水平均呈現(xiàn)出弱的正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)均為0.30左右。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種正相關(guān)性，我們繪制了3種組織甲基化基因與非甲基化基因的基因表達(dá)水平分布圖(見圖8)，結(jié)果顯示各組織甲基化基因(黃色箱體所示)表達(dá)水平明顯高于非甲基化基因(藍(lán)色箱體所示)。

(A.所有甲基化基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；B.在啟動子和基因功能區(qū)均有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；C.只在啟動子區(qū)域有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；D.只在基因功能區(qū)有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；LM代表基因的甲基化水平；RPKM代表基因的表達(dá)水平；r代表相關(guān)系數(shù)。A.The association between level of methylation and expression level about all the methylated genes; B.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags located in promoter and gene body region; C.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in promoter region; D.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in gene body respectively in the tissue of intestine; LM represent genes’ level of methylation; RPKM represent the expression level of gene;rrepresent correlation coefficient.)
圖5 腸道組織各部分基因甲基化水平與表達(dá)量相關(guān)性
Fig.5 The association between genes’ level of methylation and expression level in intestine

(A.所有甲基化基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；B.在啟動子和基因功能區(qū)均有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；C.只在啟動子區(qū)域有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；D.只在基因功能區(qū)有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；LM代表基因的甲基化水平；RPKM代表基因的表達(dá)水平；r代表相關(guān)系數(shù)。A.The association between level of methylation and expression level about all the methylated genes; B.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags located in promoter and gene body region; C.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in promoter region; D.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in gene body respectively in the tissue of intestine; LM represent genes’ level of methylation; RPKM represent the expression level of gene;rrepresent correlation coefficient.)
圖6 呼吸樹組織各部分基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性
Fig.6 The association between genes’ level of methylation and expression level in respiratory tree

(A.所有甲基化基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；B.在啟動子和基因功能區(qū)均有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；C.只在啟動子區(qū)域有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；D.只在基因功能區(qū)有甲基化標(biāo)簽分布的基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性；LM代表基因的甲基化水平；RPKM代表基因的表達(dá)水平；r代表相關(guān)系數(shù)。A.The association between level of methylation and expression level about all the methylated genes; B.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags located in promoter and gene body region; C.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in promoter region; D.The association between level of methylation and expression level about the gene that methylation tags only located in gene body respectively in the tissue of intestine; LM represent genes’ level of methylation; RPKM represent the expression level of gene;rrepresent correlation coefficient.)
圖7 性腺組織各部分基因甲基化水平與表達(dá)量相關(guān)性
Fig.7 The association between genes’ level of methylation and expression level in gonad

(M：甲基化基因，UM：非甲基化基因。 M and UM represent methylated and unmethylated genes in tissues.)
圖8 甲基化基因和非甲基化基因的表達(dá)水平
Fig.8 Expression level of methylated and unmethylated genes

3 討論

通過對仿刺參甲基化位點(diǎn)鑒定及分布特征的分析顯示：仿刺參3種組織的甲基化位點(diǎn)主要分布于基因功能區(qū)，與之前文獻(xiàn)報(bào)道的其他無脊椎動物如海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)[19]、玻璃海鞘(Cionaintestinalis)[20]、牡蠣(Crassostreagigas)[21]等基因組甲基化位點(diǎn)分布狀況類似。甲基化位點(diǎn)類型分析顯示CG型甲基化位點(diǎn)明顯多于CHG型甲基化位點(diǎn)，而在電子酶切產(chǎn)生的數(shù)據(jù)中CHG型位點(diǎn)多于CG型，可能的原因在于實(shí)際情況中符合酶切位點(diǎn)的堿基組成可能未發(fā)生甲基化，同時(shí)表明CG型堿基組成更容易發(fā)生甲基化。對基因功能區(qū)甲基化位點(diǎn)特征分析顯示，甲基化位點(diǎn)密度要遠(yuǎn)小于已報(bào)道的無脊椎動物[18]，主要的原因可能是：(1)為防止假陽性位點(diǎn)而提高篩查標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致遺漏部分真實(shí)甲基化位點(diǎn)；(2)參照基因組并未拼接完全，影響標(biāo)簽比對結(jié)果。

仿刺參組織DNA甲基化總體分布特征(標(biāo)簽在功能區(qū)的分布比例)差別較小，而甲基化水平與基因表達(dá)水平呈弱的正相關(guān)性。對各組織之間DNA甲基化圖譜的比較分析發(fā)現(xiàn)仿刺參各組織之間甲基化差異程度較小，甲基化位點(diǎn)分布以及類型一致性較高。不同組織中甲基化位點(diǎn)的總體分布規(guī)律及基因甲基化水平與表達(dá)水平相關(guān)性呈現(xiàn)出較高的一致性，這可能跟特定物種的甲基化分布規(guī)律有關(guān)。同時(shí)，各組織的甲基化也存在各自的特異性。首先各組織均有其特有的一部分甲基化基因，其次各組織之間相同基因的甲基化水平有所差異，仿刺參3種組織甲基化差異的基因涉及多種生物學(xué)過程，主要包括繁殖、壓力應(yīng)激、大分子合成等，對應(yīng)于不同組織的不同功能。

對3種組織甲基化基因的甲基化水平與表達(dá)水平的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，甲基化標(biāo)簽的分布區(qū)域基本不影響基因甲基化水平與基因表達(dá)量之間的相關(guān)性，而且各部分基因甲基化水平與表達(dá)量均呈現(xiàn)出弱的正相關(guān)趨勢；而圖8則顯示各組織中發(fā)生甲基化的基因表達(dá)水平普遍高于未發(fā)生甲基化的基因，且3種組織結(jié)果一致。以上結(jié)果暗示了仿刺參基因組中DNA甲基化可能起到促進(jìn)基因表達(dá)的作用，之前牡蠣的研究結(jié)果也呈現(xiàn)出了類似的規(guī)律[22]。這種促進(jìn)表達(dá)的可能的機(jī)制一是不同于脊椎動物甲基化主要分布在promoter區(qū)，而已研究的無脊椎動物(如仿刺參、牡蠣等)的甲基化主要發(fā)生在基因區(qū)，暗示了它們甲基化的功能可能存在一定的差異，二是甲基化會抑制某些轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)其宿主基因的表達(dá)[23]，另外，某些組蛋白修飾(如H3K36me3)能夠召集甲基化酶[24]，從而促進(jìn)基因的表達(dá)。但是考慮到DNA甲基化與基因表達(dá)相互關(guān)系的復(fù)雜性及相關(guān)證據(jù)目前還較少，因此對于無脊椎動物中DNA甲基化與基因表達(dá)相互關(guān)系的規(guī)律探究還需要更深入的研究和更多的證據(jù)。

本文通過分析仿刺參3種組織的DNA甲基化文庫數(shù)據(jù)，得到了組織的甲基化位點(diǎn)類型、分布以及概況等詳細(xì)信息，分析了其甲基化特性，并通過整合甲基化文庫數(shù)據(jù)與已有的表達(dá)譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)仿刺參基因組DNA甲基化與基因表達(dá)之間呈弱的正相關(guān)性，為無脊椎動物基因組甲基化研究提供可用信息。