張寧 曾智 閻麗萍 楊珂 孫慶文 黃鵬

胃癌是中國(guó)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病和死亡人數(shù)約占世界的50%［1］，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多基因和多因素的共同作用，其中幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）感染與胃癌發(fā)生存在密切的關(guān)系，但其作用機(jī)理目前尚不明確。多梳抑制復(fù)合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）是一組轉(zhuǎn)錄抑制因子，其核心成分果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，通過對(duì)組蛋白H3進(jìn)行甲基化修飾，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，有關(guān)HP感染是否影響表觀調(diào)控因子PRC2的表達(dá)尚缺乏報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌組織中PRC2家族蛋白和組蛋白H3K27me3的表達(dá)情況，分析HP感染與上述蛋白表達(dá)的相關(guān)性，探索HP感染在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 選取復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院2014年1月至2017年10月行胃癌手術(shù)的84例患者，其中男性55例，女性29例，平均年齡53歲。所有患者術(shù)前未經(jīng)任何抗腫瘤治療且術(shù)后均得到明確的病理診斷。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查［批號(hào)：（2017）倫審（060備）］，所有患者簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 HP快速尿素酶法檢測(cè)試劑盒購(gòu)于山東博邁達(dá)生物科技有限公司；DNA提取和PCR試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自福州邁新公司；EZH2抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，SUZ12、EED和H3K27me3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 取手術(shù)切除的胃癌組織并在距癌灶5 cm處取癌旁組織。胃癌標(biāo)本分成3份，1份經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制片，用于HP染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)；1份用于快速尿素酶檢測(cè)；1份置于-80℃冰箱保存用于PCR檢測(cè)。

1.2.2 HP快速尿素酶檢測(cè) 新鮮胃黏膜（1 mm3）取樣后立即置于加有底物反應(yīng)液的試管內(nèi)，充分震蕩，室溫靜置5 min，觀察試管內(nèi)液體顏色。如果呈黃色，為陰性；如果呈淺紅色～玫瑰紅色，為陽(yáng)性。

1.2.3 HP染色 采用改良的Giemsa染色法檢測(cè)HP。石蠟切片脫蠟至水，置于0.5%鹽酸酒精中10 min，充分水洗后將切片置于Giemsa工作液中經(jīng)微波爐加熱2～4 min。然后用1%冰醋酸快速浸洗，水洗，脫水，透明，封片。

1.2.4 PCR檢測(cè) 1）組織DNA提?。簩龃娴奈附M織剪碎、勻漿，加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），55℃水浴1 h完全消化后按照試劑盒說明書操作，提取DNA進(jìn)行純度測(cè)定；2）引物設(shè)計(jì)：針對(duì)VacA基因設(shè)計(jì)引物如下：F'：5-GGAGCCCCAGGAAACATTG-3'，R：5'-CTGCTTG AATGCGCCAAAC-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；3）PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)總體積為50 μL，上、下游引物各2 μL，應(yīng)用Touchdown PCR方法擴(kuò)增基因，94℃預(yù)變性4 min，94℃變性0.5 min，自65℃～50℃每降3℃循環(huán)3次，最后1個(gè)溫度循環(huán)15次，所有循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10 min。

1.2.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè) 石蠟切片脫蠟至水，微波修復(fù)抗原10 min，PBS洗滌，3%過氧化氫孵育20 min。山羊血清37℃封閉30 min，洗滌，分別滴加兔抗人EZH2抗體（1:200）、SUZ12抗體（1:100）、EED抗體（1:200）和鼠抗人H3K27me3抗體（1:100），4℃過夜。PBS洗滌后，分別滴加羊抗兔和兔抗鼠二抗工作液，溫箱中孵育30min。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素，孵育30 min，DAB顯色，終止反應(yīng)。結(jié)腸癌和乳腺癌組織（由上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室收集與提供）用作陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照用PBS替代一抗。

1.2.6 免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀 隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×400），計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，以≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分；對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分，無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項(xiàng)得分相加，≥3分定義為陽(yáng)性，＜3分定義為陰性。所有切片均由兩名病理醫(yī)生獨(dú)立閱片和判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，PRC2家族和H3K27me3蛋白的表達(dá)，以及與HP感染和臨床病理資料之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HP檢測(cè)結(jié)果

84例胃癌患者，HP快速尿素酶檢測(cè)法檢出率為70.24%（59/84）。Giemsa染色顯示胃黏膜細(xì)胞胞質(zhì)呈粉紅色，胞核呈藍(lán)色或紫色，HP呈淡藍(lán)色或藍(lán)色，彎曲狀或弧形（圖1A），HP檢出率為61.90%（52/84）。電泳結(jié)果顯示，VacA基因擴(kuò)增電泳條帶分子量為353 bp（圖1B），PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為76.19%（64/84）。3種檢測(cè)方法中任一結(jié)果為陽(yáng)性者均判為陽(yáng)性。

2.2 PRC2家族和H3K27me3蛋白在胃癌組織中的表達(dá)

PRC2家族中3個(gè)成員EZH2、SUZ12和EED以及H3K27me3蛋白在胃癌組織中的表達(dá)均定位于細(xì)胞核，為棕黃色顆粒（圖2A～D）。EZH2、SUZ12、EED和H3K27me3蛋白在胃癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為79.76%（67/84）、77.38%（65/84）、40.48%（34/84）和69.05%（58/84），均顯著高于癌旁組織（22.60%、34.52%、8.33%和14.29%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.3 EZH2和H3K27me3蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

本研究分析了EZH2和H3K27me3蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)EZH2和H3K27me3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例EZH2和H3K27me3蛋白表達(dá)均顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例（P＜0.05，表2），與胃癌患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、Lauren分型、分化程度、TNM分期和生存時(shí)間均無顯著相關(guān)性。

2.4 胃癌組織中PRC2和H3K27me3蛋白表達(dá)與HP感染的關(guān)系

在HP陽(yáng)性胃癌組織中，EZH2、SUZ12、EED和H3K27me3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為89.06%（57/64）、84.38%（54/64）、46.88%（30/64）和82.81%（53/64），均顯著高于HP陰性胃癌組織（50.00%、55.00%、20.00%和25.00%，P＜0.05）。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）。

2.5 胃癌組織中EZH2與H3K27me3蛋白表達(dá)的關(guān)系

胃癌組織中，67例EZH2表達(dá)陽(yáng)性的病例中H3K27me3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為74.63%（50/67），17例EZH2表達(dá)陰性的病例中H3K27me3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為47.06%（8/17），前者顯著高于后者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），EZH2與H3K27me3蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（表4）。

圖1 HP檢測(cè)結(jié)果

圖2 PRC2家族蛋白和H3K27me3在胃癌組織中的表達(dá)（SP法×40）

表1 PRC2家族蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

表2 EZH2和H3H27me3蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 EZH2和H3H27me3蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系（續(xù)表2）

表3 PRC2和H3K27me3蛋白在HP陽(yáng)性及陰性胃癌組織中的表達(dá)

表4 胃癌組織中EZH2和H3K27me3蛋白表達(dá)的關(guān)系

3 討論

近年來，中國(guó)胃癌的發(fā)病率不斷升高，在胃癌高發(fā)地區(qū)，成人HP感染率超過56%［2］。HP致癌機(jī)制與尿素酶造成的胃黏膜屏障損傷、空泡細(xì)胞毒素（VacA）和細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白（CagA）引起的基因突變和免疫反應(yīng)有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，HP感染可顯著提高水通道蛋白（Aquaporin 3）和缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）表達(dá)，使人胃癌細(xì)胞AGS和GES-1活性氧含量增加，加重胃黏膜上皮細(xì)胞損傷［3］；還可以調(diào)節(jié)環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和15羥基前列腺素脫氫酶（15 hydroxy prostaglandin dehydrogenase，15PGDH）表達(dá)進(jìn)而使前列腺素E2水平上升［4］；此外，還可通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κB上調(diào)miR-223-3p表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游靶基因ARID1A表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［5］。MABK通路中EGFR、RAF和MERK等分子在HP感染時(shí)表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而引發(fā)高胃泌素血癥［6］。HP感染還可通過miR-181b激活I(lǐng)L-6/STAT3信號(hào)途徑，進(jìn)而抑制尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子（caudal type homeobox transcription factor 2，CDX2）表達(dá)和p53信號(hào)通路，導(dǎo)致胃癌預(yù)后不良［7］。目前，有關(guān)HP致癌機(jī)制的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但仍未完全闡述清楚，特別是HP感染是否影響表觀調(diào)控因子的表達(dá)。本研究通過分析HP感染與胃癌組織PRC2家族蛋白和組蛋白H3K27me3表達(dá)的相關(guān)性，尋找其可能的致癌機(jī)制。

PRC2是一組轉(zhuǎn)錄抑制因子，核心成分EZH2基因位于7q35，其編碼產(chǎn)物能對(duì)組蛋白進(jìn)行甲基化修飾，維持下游靶基因沉默，從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)研究表明，EZH2在惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，是預(yù)后不良的指標(biāo)［8-13］。本研究結(jié)果顯示，EZH2蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，且與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，這與既往文獻(xiàn)報(bào)道相一致［12-13］。Chen等［14］研究表明，EZH2在胃癌組織中高表達(dá)，且與腫瘤的大小、浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)上述因素與胃癌組織中EZH2的表達(dá)均無顯著相關(guān)性。Mattioli等［15］研究發(fā)現(xiàn)，EZH2表達(dá)水平與腫瘤類型有關(guān)，在腸型胃癌中的表達(dá)明顯高于彌漫型胃癌。本研究結(jié)果顯示，EZH2的表達(dá)水平與胃癌Lauren分型無關(guān)。EZH2單獨(dú)存在時(shí)不具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，需要在PRC2家族另外兩個(gè)成員SUZ12和EED的共同參與下構(gòu)成復(fù)合物，才能發(fā)揮酶活性。由此可見，SUZ12和EED對(duì)于維持復(fù)合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和EZH2的酶活性是必需的［16-18］。有研究報(bào)道，SUZ12在結(jié)直腸癌、肝癌和乳腺癌中表達(dá)均上調(diào)［19-20］。本研究對(duì)SUZ12和EED蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明胃癌組織中SUZ12和EED蛋白的表達(dá)率顯著高于癌旁組織。

組蛋白是染色質(zhì)的基本組成單位，尾部某些氨基酸殘基發(fā)生修飾后可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而影響基因的表達(dá)。組蛋白H3的N末端賴氨酸殘基K27（H3K27）是最常見的甲基化修飾位點(diǎn)，三甲基化修飾后的組蛋白H3K27me3能抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控基因的表達(dá)。有關(guān)H3K27me3蛋白在腫瘤中的表達(dá)水平和臨床意義的報(bào)道不盡相同，在肝細(xì)胞癌和膀胱癌中表達(dá)上調(diào)且預(yù)后不良［21-22］，而在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中表達(dá)均下調(diào)，且與預(yù)后不良相關(guān)［23］。作為EZH2的甲基化修飾對(duì)象，本研究對(duì)H3K27me3蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該蛋白在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。

本研究對(duì)胃癌組織中PRC2家族蛋白表達(dá)與HP感染的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該家族蛋白在HP陽(yáng)性胃癌組織中的表達(dá)顯著高于HP陰性胃癌組織，提示HP感染不僅與PRC2家族核心成員EZH2表達(dá)上調(diào)呈正相關(guān)，還與該家族中另外兩個(gè)成員SUZ12和EED表達(dá)上調(diào)也相關(guān)。進(jìn)一步分析HP感染與胃癌組織中H3K27me3蛋白表達(dá)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，H3K27me3在HP陽(yáng)性胃癌組織中的表達(dá)顯著高于HP陰性胃癌組織，且與EZH2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示HP感染與H3k27me3蛋白的表達(dá)相關(guān)。

綜上所述，HP感染與胃癌組織中PRC2和H3K27me3蛋白表達(dá)上調(diào)相關(guān)，這為闡述病原體對(duì)宿主轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響提供了新的證據(jù)，也為探索HP致癌機(jī)制提供了新思路。但HP是否直接影響胃癌細(xì)胞中PRC2的表達(dá)，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。