李蘊(yùn)玉， 李佩國， 張召興， 閆艷娟， 賈青輝， 常超越， 張香齋

(河北科技師范學(xué)院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 秦皇島 066604)

雞大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(APEC)引起不同日齡的雞發(fā)生氣囊炎、肝周炎、心包炎、急性敗血癥等多種癥狀的總稱。大腸桿菌是重要的條件致病菌，具有較多的血清型，不同的地區(qū)流行的血清型也不一樣。由于抗生素在養(yǎng)雞生產(chǎn)中的不合理使用，導(dǎo)致了大腸桿菌產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，同時(shí)也造成了藥物殘留，嚴(yán)重危害著人類的健康。

中藥不僅對雞致病性大腸桿菌具有直接或者間接的殺滅作用，清除致病性大腸桿菌在雞體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)毒素，還可以消除致病性大腸桿菌耐藥質(zhì)粒，降低耐藥性[1]，并通過多個(gè)途徑調(diào)整機(jī)體的免疫機(jī)能，從而增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力，具有不易產(chǎn)生耐藥性、低殘留等優(yōu)點(diǎn)[2]。有關(guān)中藥防治雞大腸桿菌病的相關(guān)報(bào)道較多，但中藥對耐藥性大腸桿菌的抑菌活性以及防治效果的報(bào)道較少。為此，本試驗(yàn)采用24種中藥水提物對河北地區(qū)分離的雞源耐藥性E.coli地方流行株進(jìn)行體外抑菌活性試驗(yàn)，篩選出敏感的中藥，為進(jìn)一步研究抗耐藥性E.coli復(fù)方中藥制劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922、河北地區(qū)雞源耐藥性E.coli地方流行株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)，由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑及儀器 五味子、黃連、金銀花、訶子等24種中藥(購自秦皇島民樂醫(yī)藥有限公司)；普通營養(yǎng)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯均(購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；1%紅四氮唑、96孔細(xì)菌培養(yǎng)板(購自美國Corning公司)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(由上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn))；高速中藥粉碎機(jī)(由青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司生產(chǎn))；常規(guī)的試劑與儀器由本實(shí)驗(yàn)提供。

1.3 菌液的計(jì)數(shù) 參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[6]，取出-80 ℃保存大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌ATCC25922、河北地區(qū)雞源耐藥性E.coli地方流行株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)菌種進(jìn)行復(fù)蘇，將復(fù)蘇的菌種培養(yǎng)至對數(shù)生長期，利用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4 中藥水提物的制備 用水提法制備中藥水提物，取各單味中藥100 g，粉碎后稱重，加入8～10倍蒸餾水浸泡1 h，煮開后慢火煮20 min左右，12層紗布過濾，用同樣方法再煮1次，過濾，合并2次煮的藥液進(jìn)行濃縮，使其濃度為1 g/mL，離心后調(diào)整pH值為7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單味中藥水提物體外抑菌圈直徑的測定 采用平板瓊脂打孔法方法，進(jìn)行檢測單味中藥水提物體外抑菌圈直徑的大小，判定標(biāo)準(zhǔn)：15 mm≤抑菌直徑<20 mm為高敏；10 mm≤抑菌直徑<15 mm為中敏;10 mm以下為低敏[3-4]。

1.6 單味中藥水提物最小抑菌濃度(MIC)的測定 參照文獻(xiàn)報(bào)道的改良微量二倍稀釋法測定單味中藥的MIC[5]。在96孔細(xì)菌培養(yǎng)板第1～11孔每孔加入100 μL營養(yǎng)肉湯，第1孔加入100 μL中藥水提物藥液(1g/mL)，倍比稀釋到第9孔后棄100 μL，第10孔陰性對照孔，第11孔陽性對照孔，除第10孔外，每孔加10 μL菌液(108CFU/mL)，37 ℃培養(yǎng)24 h后，接種于普通培養(yǎng)基上，無菌生長的稀釋梯度為該藥的MIC。

2 結(jié)果

2.1 單味中藥水提物體外抑菌圈直徑測定結(jié)果 由表1可知，3株雞耐藥性E.coli地方株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均對訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參6種中藥高度敏感；分離株QH15(O2)、QH16(O38)對地丁高度敏感；QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均對金銀花、夏枯草、連翹3種中藥中度敏感；QH15 (O2)、QH16(O38)對青皮中度敏感；QH17(O89)對女貞子中度敏感；QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)對板藍(lán)根、白頭翁低敏；魚腥草、大黃、黃柏等9種中藥均無抑菌作用。

表1 單味中藥對雞耐藥性E.coli地方株體外抑菌試驗(yàn)(mm)

-：無敏感性

2.2 單味中藥水提物MIC測定結(jié)果 由表2可知，3株雞耐藥性E.coli地方株QH15 (O2)、QH16(O38)、QH17(O89)均對訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參6種藥物的MIC在7.825～31.25 mg/mL之間；分離株QH15(O2)、QH16(O38)對地丁、青皮的MIC為31.25 mg/mL；3株雞耐藥性E.coli地方株均對蘇木、金銀花、夏枯草、連翹4種藥物的MIC在62.5～125 mg/mL之間；3株雞耐藥性E.coli地方株均對板藍(lán)根、白頭翁2種藥物的MIC在125～250 mg/mL之間。魚腥草、大黃、黃柏等9種中藥對標(biāo)準(zhǔn)菌株及3株雞耐藥性E.coli地方株均沒有效果。

表2 單味中藥對雞耐藥性E.coli地方株的MIC (mg/mL)

-：無敏感性

3 討論

在本試驗(yàn)中，筆者采用瓊脂擴(kuò)散法和改良微量二倍稀釋法測定了24種中藥水提物對雞源耐藥性E.coli地方流行株的體外抑菌活性，結(jié)果表明，3株雞耐藥性E.coli地方株對訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參6種中藥的抑菌圈直徑在15～24 mm之間，MIC在7.825～31.25 mg/mL之間，均高度敏感；而分離株對QH15 (O2)、QH16(O38)對青皮的抑菌圈直徑為13 mm，中度敏感，但MIC為31.25 mg/mL，說明這兩種方法測定中藥抑菌活性具有一定的相關(guān)性，同時(shí)也存在一定的差異性，與張賽奇等[5]報(bào)道相一致。

本次試驗(yàn)選取中藥可以分為清熱藥、攻下藥、收澀藥、解表藥、理氣藥等。24種中藥對河北地區(qū)的3個(gè)不同血清型的雞耐藥性大腸桿菌地方流行株體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，訶子、五味子、五倍子、黃連、黃芩、苦參的抑菌效果明顯，其共同點(diǎn)在于都具有清熱燥濕、澀腸止瀉的功用。金銀花、夏枯草、連翹的抑菌效果次之，而魚腥草、大黃、黃柏等則沒有表現(xiàn)出抑菌效果。其結(jié)果與張立永[6]報(bào)道的通過對耐藥性大腸桿菌優(yōu)勢血清型O1+O148流行株篩選出的敏感中藥存在一定的差異性，其原因可能與雞耐藥性大腸桿菌流行的血清型、中藥的生長環(huán)境及提取工藝有關(guān)。中藥水提法提取中藥有效成分過程中，由于加熱可能使抑菌的物質(zhì)的活性降低或者破壞，從而影響了抑菌效果。另外中藥水提物還需要高壓蒸汽滅菌，在滅菌的過程中也可能降低抑菌活性，影響抑菌效果。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究抗耐藥性E.coli組方中藥制劑提供科學(xué)依據(jù)。