艾民珉湯 婷蔣愛民楊益嘉游玉婷

(1. 華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2. 畜禽產(chǎn)品精準加工與安全地方聯(lián)合工程研究中心，廣東 廣州 510642；3. 廣東省畜禽產(chǎn)品加工工程技術研究開發(fā)中心，廣東 廣州 510642；4. 廣東省食品質量安全重點實驗室，廣東 廣州 510642)

皮蛋是中國傳統(tǒng)的生食蛋制品之一，具有色澤美觀、風味濃郁、營養(yǎng)豐富等特點[1-2]。皮蛋的形成主要是利用氫氧化鈉與蛋白質等成分作用，使其發(fā)生物理化學變化形成凝膠狀態(tài)[3-5]。傳統(tǒng)腌制工藝里會添加氧化鉛，而鉛的作用目前比較認可的說法是“堵孔”學說[6]，即鉛能與蛋白質等生成難溶物沉積于蛋殼和殼膜表面阻止氫氧化鈉進一步進入蛋內部，避免蛋清“堿傷”現(xiàn)象的發(fā)生[7]。但是鉛會在人體內積累，對人體健康造成危害，尤其對嬰幼兒智力發(fā)育有不良影響[8]。故近年來，學者對于皮蛋無鉛工藝研究較多[9-11]，比如采用添加鋅、銅等來替代鉛的作用，同時與氫氧化鈉等混合制成堿液，即清料法腌制液，解決了傳統(tǒng)腌制泥中重金屬超標和腌制出的皮蛋品質不穩(wěn)定等問題。

蛋黃主要由33.8%的脂肪和14.5%的蛋白質[12]組成，也是皮蛋的主要構成部分。蛋清凝膠是依靠離子鍵與二硫鍵作用形成球狀蛋白質聚集體，而蛋黃凝膠的形成受水分和鹽分的影響[13]。目前，對于皮蛋中蛋清凝膠的形成機理及改性研究較多，也較為成熟，但對于蛋黃凝膠形成機理及金屬離子調控等研究較少且仍未闡明[1]。本試驗采用清料法腌制皮蛋，對皮蛋腌制過程中蛋黃內部化學作用力和凝膠強度進行了監(jiān)測，旨在為蛋黃凝膠形成機理的探究及皮蛋品質控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鴨蛋：廣州市天河區(qū)長湴市場；

8-苯胺基-1-萘磺酸銨(ANS)：分析純，上海科順生物科技有限公司；

5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)：分析純，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器設備

紫外分光光度計：UV-2600型，日本島津公司；

熒光分光光度計：RF-5301PC型，日本島津公司；

均質機：HPH2000/4型，德國IKA公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Vertex70型，德國Bruker公司；

高速冷凍離心機：Eppendorf 5804R型，德國艾本德科技公司；

物性分析儀：TA.XT.Plus 型，英國SMS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程 選取65～75 g新鮮鴨蛋數(shù)枚，用流動水沖洗表面臟物，晾干后備用。按照以下配方配制腌制液：4.5% NaOH，3.5%食鹽，0.1% CuSO4，0.1% FeSO4，0.1% ZnSO4，0.1% 紅茶末。將晾干后的新鮮鴨蛋浸泡于腌制液中，腌制4周后出缸，流水沖凈鴨蛋表面殘留堿液后晾干，用石蠟包裹皮蛋，后熟2周。分別在腌制7，14，21，28，35，42 d時隨機選取10枚進行分析測試。

1.3.2 凝膠強度測定 使用直徑為50 mm的圓柱型探頭P/50，對每個樣品進行單軸向壓縮，壓縮距離4 mm，觸發(fā)力4.0 g。測試前速0.5 mm/s，測試速度0.5 mm/s，測試后速0.5 mm/s。

1.3.3 表面疏水性的測定 稱取1 g皮蛋黃，加入10 mL pH 7.0的磷酸緩沖液，均質后于4 000×g離心10 min，取上清液備用。將離心后的樣品上清液蛋白質濃度稀釋為0.01 mg/mL。取4 mL稀釋液，添加20 μL 8 mmol/L的ANS為熒光探針，激發(fā)波長為390 nm，掃描范圍為400～600 nm。

1.3.4 傅里葉轉換紅外線光譜分析 精確稱取100 mg KBr和1.2 mg冷凍干燥后的樣品，用瑪瑙研缽研磨至沒有光澤后壓片。將壓好的樣品置于全反射附件(ATR)上進行全波段(4 000～600 cm-1)掃描，掃描次數(shù)為16次，分辨率為4 cm-1。以相應未添加樣品的KBr為背景，扣除背景后得到紅外光譜圖。利用OMNIC 6.0數(shù)據(jù)處理軟件和Peakfit 4.12 軟件對數(shù)據(jù)進行處理，擬合后使殘差<0.01，根據(jù)各積分面積計算二級結構所占百分含量。

1.3.5 游離巰基和總巰基的測定 參考文獻[14]。

1.3.6 離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的測定 參考文獻[15]。

1.3.7 凝膠電泳(SDS-PAGE) 凝膠電泳使用5%和12%分離疊加凝膠。稱取3 g蛋黃加入27 mL 5% SDS，并于12 000 r/min 的勻漿器中快速分散1 min，將勻漿在85 ℃下加熱1 h后，于7 500×g離心10 min。用樣品處理液將蛋白質濃度調整到1 mg/mL，取20 μL進行電泳，凝膠電泳單元的恒定電壓為200 V/板，凝膠的染色用考馬斯亮藍R-250(0.125%)、25 mL/100 mL 甲醇和10 mL/100 mL 醋酸。脫色用40 mL/100 mL 甲醇和10 mL/100 mL 醋酸。

1.3.8 統(tǒng)計分析 運用Origin 8.5和SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行多重比較、LSD檢驗以及作圖。

2 結果與分析

2.1 蛋黃凝膠強度的變化

由圖1可知，腌制過程中蛋黃的凝膠強度變化顯著(P<0.05)，而在后熟期間變化不顯著(P>0.05)。腌制過程中氫氧化鈉逐漸透過蛋殼與蛋殼膜進入蛋清和蛋黃內，使得蛋清呈透明凝膠狀，而蛋黃逐漸呈外部凝膠、溏心黏稠狀。氫氧化鈉與蛋黃中油脂發(fā)生皂化反應使得表面蛋黃開始凝固，同時蛋白質發(fā)生堿變性，生成的變性蛋白質之間發(fā)生交聯(lián)，使得原本柔軟的外層蛋黃呈凝膠狀，凝膠強度在腌制期間顯著增加。皮蛋出缸后，沒有氫氧化鈉的持續(xù)滲透，且水分逐漸散失，使得蛋黃凝膠強度在28～35 d時顯著增加(P<0.05)，而后熟期間皮蛋內部微環(huán)境趨于穩(wěn)定，故在后熟過程中凝膠強度變化不明顯(P>0.05)。

圖1 凝膠強度的變化

2.2 蛋黃表面疏水性的變化

ANS可用作熒光標記來反映蛋白質的表面疏水特性及監(jiān)測蛋白質的變性過程，其常與陰離子蛋白結合[16]。皮蛋在腌制和后熟過程中的外源性熒光光譜見圖2。外層蛋黃和溏心蛋白質的熒光峰值隨腌制時間的延長逐漸降低，其中外層蛋黃峰值在14～42 d時下降顯著(P<0.05)，而溏心峰值在7～14 d時下降顯著(P<0.05)，在14～42 d時下降不明顯(P>0.05)，說明外層蛋黃在14～28 d時發(fā)生了明顯的變性，而溏心在整個腌制和后熟過程中的蛋白質變性較緩慢。氫氧化鈉的滲入，改變了酸堿平衡環(huán)境，變性后的蛋白質結構逐漸變得有序，空間結構變得可延伸，使得更多極性基團暴露。極性基團以非共價鍵的方式與滲透的陰離子及蛋白質相結合，導致非極性基團和陰離子增加，熒光強度也相應增加。而蛋清凝膠的形成使得氫氧化鈉滲透進入蛋黃的速率下降，凝固的外層蛋黃進一步減緩了氫氧化鈉滲透進入溏心的速率，說明蛋黃蛋白質的變性會使表面疏水性下降。同時，溏心蛋白質的熒光峰值是外層蛋黃的3～10倍，說明外層蛋黃蛋白質比溏心蛋白質變性嚴重。

圖2 表面疏水性的變化

2.3 FTIR結果分析

2.4 蛋黃腌制過程中游離巰基與總巰基的變化

皮蛋在腌制和后熟過程中游離巰基和總巰基的變化見圖3。外層蛋黃的游離巰基下降緩慢(P>0.05)，溏心的游離巰基和總巰基均下降顯著(P<0.05)，而外層蛋黃總巰基呈先增加后下降趨勢，在第14天時達到最大值(32.34 μmol/g·Pro)。鄭華等[20]曾報道新鮮蛋黃的巰基含量為57 μmol/g·Pro。說明蛋黃在腌制0～7 d時，巰基含量大幅度下降，而在腌制和后熟過程中游離巰基變化不明顯，原因可能是外層蛋黃蛋白質的變性等因素使得巰基在前期轉化成了二硫鍵。外層蛋黃總巰基含量比游離巰基平均高3.44 μmol/g·Pro，而溏心總巰基含量比游離巰基高0.29 μmol/g·Pro，表明外層蛋黃中分子內部巰基的數(shù)量要比溏心多。蛋黃中的蛋白質是與不同質量脂質結合的磷蛋白，共有316種，占比較高的有低密度脂蛋白(65%)、高密度脂蛋白(16%)、卵黃球蛋白(10%)和卵黃高磷蛋白(4%)[21]。其中高密度脂蛋白能在高堿度下形成聚集體但并不是依靠巰基或二硫鍵的作用，而二硫鍵是球形蛋白質形成凝膠的主要作用力，表明蛋黃中蛋白質巰基的變化主要來自于卵黃球蛋白[22-23]。蛋黃接觸氫氧化鈉的時間晚于蛋清，變性后的卵黃球蛋白快速通過化學鍵與其它蛋白質發(fā)生交聯(lián)而形成凝膠，進一步滲透的氫氧化鈉與溏心中油脂發(fā)生皂化反應，不同等電點的蛋黃蛋白質逐漸變性聚集轉變?yōu)橥鈱拥包S凝膠，形成了皮蛋蛋黃色層分明的特點。

表1 二級結構的變化

圖3 腌制和后熟過程中蛋黃游離巰基和總巰基的變化

2.5 蛋黃離子鍵、氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵的變化

蛋黃在不同腌制和后熟期間的化學作用力變化見圖4。由圖4可知，外層蛋黃中的SA和SD顯著增加(P<0.05)，溏心中的SA、SC和SD占比較大，表明外層蛋黃分子間作用力主要是離子鍵和二硫鍵，而溏心分子間作用力主要是離子鍵、疏水相互作用和二硫鍵。

離子鍵主要受負電荷的影響，能阻礙凝膠的形成，但外層蛋黃形成了凝膠，且其比例顯著增加(P<0.05)。在腌制前期氯化鈉較氫氧化鈉滲透速度快，外層蛋黃表面正電荷較多，而后期氯化鈉滲透速率下降及蛋白質變性使得表面覆蓋較多負電荷，離子鍵含量增加。溏心離子鍵占比較大且呈先增大后降低趨勢，在21 d時達到最大值66.41%。表明在前21 d時由于水分的降低以及氫氧化鈉的滲入使得蛋白質表面負電荷增加，而后期氯化鈉含量的增加降低了表面負電荷的相互作用，離子鍵降低。氫鍵是維持蛋白質二級結構的主要作用力，疏水相互作用是維持蛋白質三級結構的主導作用力，它對蛋白質結構的穩(wěn)定和功能性質具有重要的作用。有研究[24]表明蛋白質的疏水性對蛋白質分子的凝聚作用有顯著影響。外層蛋黃的SB與SC占比較小，說明氫氧化鈉的滲透造成多肽鏈末端官能團被電離，使得氫鍵和疏水相互作用占比較小。溏心的SB下降顯著(P<0.05)，SC增加明顯(P<0.05)，表明溏心蛋白質在腌制過程中逐漸發(fā)生變性而聚集形成凝膠，增加凝膠強度。二硫鍵是形成凝膠的重要化學鍵，也是維持蛋白質空間結構的重要次級鍵，當?shù)鞍踪|受到外界環(huán)境的影響時，二硫鍵會轉化為巰基，從而破壞蛋白SA表示蛋黃在溶劑A中的溶解度，代表離子相互作用；SB表示蛋黃在溶劑A與B的溶解度之差，代表氫鍵；SC表示蛋黃在溶劑B與C的溶解度之差，代表疏水相互作用；SD表示蛋黃在溶劑C與D的溶解度之差，代表二硫鍵[13]質的空間結構。外層蛋黃和溏心的SD占比均較大，變化也顯著(P<0.05)，說明在強堿作用下蛋黃蛋白質在腌制和后熟過程中發(fā)生了變性，多肽鏈之間的巰基轉化為二硫鍵，促進了蛋白質之間發(fā)生交聯(lián)并形成凝膠，提高了凝膠強度。

圖4 化學作用力的變化

Figure 4 The changes of intermolecular interaction

2.6 SDS-PAGE分析

由圖5可知，標準蛋白的分子量為14.4～97.2 kDa。以標準蛋白的遷移率作為對照，根據(jù)樣品的相對遷移率，來判斷不同腌制時期蛋黃蛋白質的變化。對比各樣品的電泳結果發(fā)現(xiàn)，外層蛋黃蛋白質的主要條帶集中在43.0 kDa附近，且條帶數(shù)量從3條減少至1條，溏心蛋白質在7 d時主要有7條，堿濃度的增加使得部分溏心蛋白質分解，條帶數(shù)量減少。外層蛋黃和溏心凝膠電泳中均在43.0 kDa附近存在條帶，該蛋白質可能是高密度脂蛋白，說明與其它蛋白質相比，高密度脂蛋白能在堿性環(huán)境中穩(wěn)定存在。在氫氧化鈉的作用下，蛋黃脂蛋白被破壞，蛋白質與油脂分離，油脂與堿發(fā)生皂化反應使得外層蛋黃開始凝固，蛋白質分解成小片段多肽，這些多肽通過內部化學鍵發(fā)生交聯(lián)包裹水分而富有彈性，凝膠強度增加。蛋黃蛋白質的電泳結果與其二級結構的變化一致。

M. 標準蛋白 外. 外層蛋黃 內. 溏心

3 結論

研究皮蛋加工過程中蛋黃內部化學作用力及其凝膠強度的變化，對揭示蛋黃凝膠的形成機理具有重要意義。結論如下：① 外層蛋黃蛋白質的變性程度強于溏心蛋白質，且其表現(xiàn)出的蛋白質表面疏水性顯著下降，影響著蛋黃內蛋白質的聚集；② 外層蛋黃凝膠的形成主要依靠離子鍵和二硫鍵的作用，氫鍵和疏水相互作用貢獻較小；③ 溏心逐漸轉變?yōu)橥鈱拥包S凝膠，形成色層分明的特點，增強了蛋黃凝膠強度，其中疏水相互作用和二硫鍵起主要作用，離子鍵和氫鍵作用顯著減弱；④ 皮蛋中大部分蛋黃蛋白質分解成小片段多肽，比較穩(wěn)定的蛋白質可能是高密度脂蛋白。本試驗對蛋黃的形成機理進行了討論，但僅監(jiān)測了各種化學作用力對蛋黃凝膠形成的影響，對于蛋黃內部各種成分對其凝膠形成的影響還有待進一步研究。