趙 旭吳世嘉樂 琳王周平,3

(1. 江南大學(xué)食品國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學(xué)國際食品安全聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

鎘(Cd)元素是一種生物蓄積性強(qiáng)、毒性持久、具有“三致”作用的劇毒元素，攝入過量的鎘對生物體的危害極其嚴(yán)重，會(huì)導(dǎo)致腎臟、肝臟、肺部、骨骼、生殖器官損傷，對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等具有毒性效應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)多種疾病[1]。鎘移動(dòng)性強(qiáng)，難以生物降解，極易通過食物鏈進(jìn)入人體，引起人體機(jī)能衰退，長期接觸會(huì)引起癌癥。目前，中國鎘污染形勢嚴(yán)峻，鎘污染事件頻發(fā)，嚴(yán)重影響了居民的正常生活和身體健康[2-3]。做好食品中鎘的分析檢測工作，對保護(hù)人體健康具有重要意義。

目前，比較成熟的重金屬離子檢測方法主要有原子吸收法(AAS)[4]、雙硫腙分光光度法[5]、催化示波極譜法[6-7]、原子熒光法(AFS)、電感耦合等離子體原子發(fā)射法(ICP-AES)[8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[9]等。這些方法都能夠提供較高的檢測靈敏度、較好的選擇性以及準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，但是普遍缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴、體積大，檢測時(shí)間長，并且樣品預(yù)處理步驟復(fù)雜、時(shí)間長、易受污染。近年來，一些依賴于納米材料或核酸適配體的新型檢測技術(shù)也常被用于簡單、快速地定量檢測重金屬離子，主要包括電化學(xué)分析法[10-11]、熒光法[12-13]、化學(xué)發(fā)光法[14]、比色分析法[15-16]等。

核酸適配體是一段具有三維空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA或RNA，它可以與靶標(biāo)發(fā)生特異性結(jié)合。因此，在構(gòu)建檢測方法時(shí)，適配體可以被用作一種優(yōu)良的分子識別元件[17]。由于適配體是在體外設(shè)計(jì)和篩選的，原則上任何靶標(biāo)都可以有它對應(yīng)的適配體，而且適配體在信號傳導(dǎo)和化學(xué)修飾方面具有更加優(yōu)良的特性[18-19]，因此應(yīng)用了適配體技術(shù)的檢測方法往往具有更高的靈敏度。

到目前為止相較于其他重金屬，有關(guān)重金屬鎘基于適配體識別的檢測方法的研究報(bào)道很少，僅有3篇[14,20-21]，但這些檢查方法對現(xiàn)場快速檢測的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值不高。本研究擬利用適配體與目標(biāo)物結(jié)合的高特異性，建立一種基于酶聯(lián)適配體的鎘離子可視化檢測方法，以實(shí)現(xiàn)對鎘離子的快速靈敏檢測，提高方法的實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

氯化鈉、牛血清白蛋白(BSA)、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

DNA：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；

親和素：化學(xué)純，美國Sigma-Aldrich公司；

鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(HRP-Streptavidin)：250 U/mg，美國Sigma-Aldrich公司；

3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液(TMB)：上海生工生物工程有限公司；

0.2 mm注射器過濾器：天津東康科技有限公司；

鎘離子標(biāo)準(zhǔn)液：100 μg/mL，1% HNO3，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

透明96孔微孔板：每孔300 μL，美國Corning公司；

超純水：18.2 mΩ，由美國Millipore凈水系統(tǒng)制備。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

紫外-可見光(UV-vis)分光光度計(jì)：Shimadzu UV-2300型，日本島津公司；

酶標(biāo)儀：BioTek Synergyh1型，美國BioTek公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9145A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

微量分析天平：AR224CN型，奧豪斯儀器中國有限公司；

實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：Starter 3C型，奧豪斯儀器中國有限公司；

超純水儀：Direct-Q3型，密理博中國有限公司；

超聲波清洗儀：KQ-800DE型，無錫科潔儀器設(shè)備公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微孔板包被親和素 將親和素用碳酸鹽緩沖液(pH 9.0)稀釋，每孔包被200 μL，4 ℃反應(yīng)12 h后，用pH 7.4 的洗滌緩沖液[1×磷酸鹽緩沖液(PBS)+0.05 mL/100 mL吐溫20]清洗3次，拍干。加入200 μL的2 g/100 g BSA溶液以封閉未完全被親和素包被的微孔板，37 ℃下放置30 min，拍干，用洗滌緩沖液洗滌3次，拍干。

1.2.2 HRP-互補(bǔ)鏈復(fù)合物的制備 將稀釋1 000倍的HRP-Streptavidin與20 nmol/L的生物素化互補(bǔ)鏈[5’-biotin-CGC AAC GCT CGC TCA TAC TGC ACA ACC AAA-3’(DNA2)]混合，37 ℃孵育30 min，然后置于-20 ℃冷凍保存，備用。

1.2.3 鎘離子標(biāo)準(zhǔn)樣品的定量檢測 在微孔板中加入10 μL 的生物素化適配體[20][5’-biotin-ACC GAC CGT GCT GGA CTC TGG ACT GTT GTG GTA TTA TTT TTG GTT GTG CAG TAT GAG CGA GCG TTG CG-3’(DNA1)]，37 ℃ 孵育30 min后，用pH 7.4的洗滌緩沖液清洗3次，拍干。將100 μL鎘離子樣品加到微孔板中，37 ℃孵育30 min，用洗滌緩沖液清洗3次，拍干。然后將HRP-互補(bǔ)鏈復(fù)合物加到微孔板中，37 ℃孵育30 min，用洗滌緩沖液清洗3次，拍干。最后在每孔中加入100 μL TMB顯色試劑，室溫放置20 min，加入100 μL的2 mL/100 mL硫酸溶液，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定其吸光度值。

1.2.4 實(shí)際樣品的檢測 利用本方法對自來水中重金屬鎘離子含量進(jìn)行檢測。用0.2 mm注射過濾器對實(shí)際樣品進(jìn)行過濾，隨后在樣品中添加1，3 ng/mL濃度的鎘離子標(biāo)品，用本試驗(yàn)中設(shè)計(jì)的方法對其進(jìn)行檢測，得到鎘離子的濃度值并計(jì)算回收率，與石墨爐原子吸收光譜法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬鎘離子可視化檢測設(shè)計(jì)原理

如圖1所示：生物素標(biāo)記的鎘離子適配體能夠特異性地識別和結(jié)合鎘離子，從而實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)的捕獲。檢測體系中的目標(biāo)物鎘離子通過親和素與生物素的結(jié)合從而被固定到包被有親和素的微孔板的底部，然后再向孔內(nèi)加入生物素標(biāo)記的適配體互補(bǔ)鏈和鏈霉親和素-HRP的復(fù)合物。此時(shí)，由于適配體與目標(biāo)物質(zhì)鎘離子結(jié)合時(shí)構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致適配體互補(bǔ)鏈不能與其雜交結(jié)合，HRP-互補(bǔ)鏈復(fù)合物只能通過結(jié)合未捕獲靶標(biāo)的適配體固定到板底。隨后再加入TMB顯色劑，在HRP的作用下，TMB會(huì)被氧化，并且會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色的產(chǎn)物；加入酸后，產(chǎn)物的顏色會(huì)變?yōu)辄S色可被肉眼觀測，并且在450 nm處有最大吸收峰，從而實(shí)現(xiàn)鎘離子的可視化檢測。

圖1 鎘離子可視化檢測原理圖

2.2 微孔板包被親和素濃度優(yōu)化

適配體是通過生物素和親和素的連接作用固定于微孔板上的，微孔板上的親和素包被量會(huì)直接影響適配體在板底的結(jié)合量，因此合適的親和素包被濃度是試驗(yàn)成功的基礎(chǔ)，于是對親和素的包被濃度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見圖2。由圖2可知，當(dāng)親和素濃度達(dá)到20～22 μg/mL時(shí)，A450差值基本達(dá)到飽和，此時(shí)檢測效果最佳，為了節(jié)省親和素用量，本試驗(yàn)中親和素包被濃度采用20 μg/mL。

2.3 生物素化鎘離子適配體濃度優(yōu)化

生物素標(biāo)記的適配體濃度將直接影響板底連接的適配體量，為了探究適配體濃度對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，對適配體濃度進(jìn)行了優(yōu)化，得到試驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著適配體濃度增大，固定到酶標(biāo)板底部的互補(bǔ)鏈和引入檢測體系中的HRP量也會(huì)不斷增加，從而使A450值也不斷增加。但是當(dāng)適配體濃度達(dá)到200 nmol/L時(shí)，A450值基本達(dá)到飽和，證明此時(shí)適配體的量已經(jīng)達(dá)到飽和，因此試驗(yàn)中選取200 nmol/L 為適配體加入濃度。

圖2 親和素濃度的優(yōu)化

圖3 生物素標(biāo)記的鎘離子適配體濃度優(yōu)化

2.4 HRP修飾互補(bǔ)鏈序列濃度優(yōu)化

互補(bǔ)鏈濃度會(huì)影響最終連接到板底的HRP酶的量，為了探究適配體互補(bǔ)鏈濃度對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，對互補(bǔ)鏈濃度進(jìn)行了優(yōu)化，得到試驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著互補(bǔ)鏈濃度的增加，A450值也隨之逐漸增大，當(dāng)互補(bǔ)鏈濃度達(dá)到20 nmol/L時(shí)，A450值基本達(dá)到飽和，證明此時(shí)互補(bǔ)鏈剛好飽和，因此選取互補(bǔ)鏈濃度為20 nmol/L。

圖4 互補(bǔ)鏈濃度優(yōu)化

2.5 線性范圍與檢測限

在最佳的試驗(yàn)條件下，用本研究的檢測方法檢測不同濃度、同體積的鎘離子標(biāo)準(zhǔn)液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鎘離子濃度與A450在0.1～5.0 ng/mL時(shí)呈良好線性，校正曲線方程為y=-0.048 3x+0.439 6，檢出限為0.05 ng/mL(S/N=3)。對濃度為2.0 ng/mL的鎘離子樣品液平行測定3次，最后求得相對標(biāo)準(zhǔn)差為5.2%。

圖5 鎘離子濃度與A450的關(guān)系曲線

2.6 特異性

為了驗(yàn)證此檢測方法的特異性，選擇了10種金屬離子(Hg2+，Pb2+，F(xiàn)e3+，Mn2+，Mg2+，K+，Ag+，Cu2+，Al3+，Zn2+)與鎘離子在最優(yōu)條件下進(jìn)行試驗(yàn)。鎘離子與其他對照組樣品濃度均為5 ng/mL。將空白孔與各個(gè)金屬離子檢測后所得到的A450差值進(jìn)行比較，結(jié)果見圖6。由圖6可知，鎘離子與其他金屬離子的差值差距明顯，且試驗(yàn)現(xiàn)象可用肉眼觀測到，表明本方法具有良好的特異性。

圖6 檢測方法特異性考察

2.7 實(shí)際樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

為了對試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，用試驗(yàn)中構(gòu)建的方法對自來水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，并將試驗(yàn)結(jié)果與國標(biāo)方法——石墨爐原子吸收光譜法進(jìn)行對比。測得未加標(biāo)自來水樣品中含有鎘離子，本底值為1.316 ng/mL，將檢測結(jié)果扣除本底值后得到結(jié)果見表1。從表1可以看出，綜合本方法檢測實(shí)際樣品所得結(jié)果與原子吸收光譜法相比差異小，獲得了良好的回收率，表明本方法具有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，可用于鎘離子的實(shí)際樣品檢測。

表1 鎘離子加標(biāo)回收率

3 結(jié)論

本研究成功建立了一種基于單鏈ssDNA適配體檢測重金屬鎘離子的可視化方法。方法的最低檢測限為0.05 ng/mL，且在自來水實(shí)際樣品的檢測中所得結(jié)果與傳統(tǒng)的原子吸收光譜法高度一致，表明本方法可以用于實(shí)際樣品檢測。本方法具有操作簡便、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，可為重金屬分析檢測研究提供一種全新的可行途徑。