姬中偉戴甜甜毛 健

(1. 江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

谷子是中國北方的主要糧食作物之一[1]，脫殼后為小米。小米的各種營養(yǎng)素比例適宜，是一種良好的營養(yǎng)源[1]。相比稻米和小麥，小米中的碳水化合物含量比例不高，約為60%～70%[2]，小米中蛋白質(zhì)的消化率為83.4%，生物價為57，高于大米和大麥[3]，同時，小米蛋白也是一種優(yōu)良蛋白質(zhì)的供應(yīng)源，可應(yīng)用于食用蛋白、營養(yǎng)強(qiáng)化劑及食品添加劑等多個食品領(lǐng)域[4]。小米蛋白經(jīng)酶解處理后得到的多肽具有抗氧化性等功效[5-6]。古世祿等[7]指出絕大多數(shù)谷子品種蛋白質(zhì)含量為10.00%～13.99%。小米中蛋白質(zhì)具有低過敏性的優(yōu)良特點(diǎn)，主要分布在小米的胚和胚乳中[8]，基本組成有以下四類蛋白：清蛋白、球蛋白、醇蛋白和谷蛋白[9]。魏益民等[10]采用Osborne法提取小米蛋白，結(jié)果顯示醇溶蛋白和堿溶蛋白所占比例分別為46.0%和21.2%，相對而言，清蛋白和球蛋白含量較低，二者共占5.5%。小米蛋白的提取有堿法和鹽法[11]，楊樺等[12]采用超聲波輔助酶法提取小米蛋白，使得提取率明顯提高。然而目前針對小米蛋白結(jié)構(gòu)特性(如蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組成、蛋白表面形態(tài)等)的研究較為缺乏，未見國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報道。

本試驗(yàn)擬采用堿提酸沉法提取小米谷蛋白，并用乙醇提取小米醇溶蛋白[13-14]，然后對得到的2種蛋白的分子量分布及結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，為小米蛋白的進(jìn)一步深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃小米：沁黃2號沁州，山西沁州黃小米(集團(tuán))有限公司；

無水乙醇、正己烷、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銨、氯化鋇、氯化鈉、硝酸銀等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：EL3002型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

低速大容量多管離心機(jī)：RJ-LDL-50G型，無錫市瑞祥分析儀器有限公司；

pH計：FiveEasy Plus型，范圍為0.08～14.00，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

高速粉碎機(jī)：DFY-300型，溫嶺市林大機(jī)器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-2100型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

膠體磨：MF-50型，杭州惠合機(jī)械設(shè)備有限公司；

各劑量組實(shí)驗(yàn)中期及實(shí)驗(yàn)結(jié)束前采尾血測定各劑量組血常規(guī)各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)（血紅蛋白、紅細(xì)胞計數(shù)、白細(xì)胞計數(shù)及其分類）。結(jié)果與對照組比較均無顯著性差異(p＞0.05)，且各項(xiàng)指標(biāo)均在本實(shí)驗(yàn)室正常值范圍內(nèi)。

高壓均質(zhì)機(jī)：NS2006L型，德國GEA集團(tuán)；

圓二色光譜儀：MOS-450型，美國Biologic公司；

原子力顯微鏡：Demension ICON型，德國布魯克科技有限公司；

冷凍干燥機(jī)：BETA 2-8-LD plus型，德國Christ公司；

X射線衍射儀：D2 PHASER型，德國布魯克AXS有限公司；

電泳儀：Mini-PROTEAN?Tetra型，美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 小米脫脂 稱取500 g小米，用粉碎機(jī)充分粉碎后過50目篩，稱量，室溫下用1∶2 (g/mL)的正己烷攪拌浸泡4 h，用保鮮膜密封，脫去脂肪，重復(fù)1次。將脫脂后的小米在空氣中干燥12 h，于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 小米蛋白的提取

(1) 小米谷蛋白的提取： ① 取300 g脫脂后的小米按1∶15 (g/mL)比例加入蒸餾水，用膠體磨在2 800 r/min轉(zhuǎn)速下處理2次，磨齒間隙為5 μm，然后在40 MPa壓力下循環(huán)均質(zhì)1 h；② 用0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 8.5～8.8，攪拌30 min，靜置4 h；③ 所得上清液用0.5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 4.5，靜置30 min后，于5 000 r/min離心15 min，沉淀水洗2次，冷凍干燥后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2) 小米醇溶蛋白的提?。簩?.2.2(1)中第2步靜置后所得的沉淀按1∶6 (g/mL)加入體積分?jǐn)?shù)65%乙醇在35 ℃條件下攪拌浸提4 h，4 500 r/min離心20 min得上清液，向上清液中緩緩加入鹽水，同時攪拌，直至體積達(dá)到原上清液的3倍，溶液中氯化鈉濃度達(dá)到0.3 g/100 g。于0～4 ℃環(huán)境下放置1 d，使醇溶蛋白沉淀析出來，并使用8～12 kDa透析袋將沉淀透析除鹽，處理時間為1 d，透析液為去離子水。透析過程中經(jīng)常更換透析液，直到向其中加入AgNO3溶液后沒有明顯的白色沉淀物出現(xiàn)為止，蛋白沉淀經(jīng)冷凍干燥后在-20 ℃保存待用。

(3) SDS-PAGE分析：參考Laemmli[15]報道的方法并略做修改。采用Biosharp凝膠制備試劑盒，制備濃度為10%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠，取1 g/L蛋白樣品100 μL和SDS-PAGE樣品緩沖液25 μL于500 μL離心管中，煮沸處理1 min，5 000 r/min離心1 min。吸取20 μL上清液開始進(jìn)樣，在室溫下電泳處理，將濃縮膠中電壓恒定為100 V，電泳過程中注意觀察樣品，當(dāng)前端到達(dá)分離膠時，將電壓增加為150 V。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)染色處理膠片，用去離子水脫色。

(4) 圓二色光譜分析(CD)：參考趙小莉等[16]的分析方法并稍加修改。稱取一定量的谷蛋白和醇溶蛋白，用65%乙醇溶解醇溶蛋白配制成1 mg/mL蛋白溶液，谷蛋白加水溶解使其濃度為1 mg/mL，并調(diào)節(jié)pH 12.0。采用圓二色光譜儀在遠(yuǎn)紫外區(qū)域(190～250 nm)掃描，光譜間隔0.1 nm，掃描速度為50 nm/min。所得數(shù)據(jù)經(jīng)Origin 8.0進(jìn)行擬合，針對以上2種蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)在分析網(wǎng)站(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml)上做模擬和分析。

(5) X射線衍射分析(XRD)：根據(jù)Guerrero等[17]和Naidja等[18]提供的方法稍作調(diào)整。利用D2 PHASER型X-衍射儀進(jìn)行測定。相關(guān)參數(shù)：采用Cu Kα石墨單色器，電壓40 kV，掃描速度0.05°/s，掃描范圍3°～50°。

(6) 原子力顯微鏡分析(AFM)：根據(jù)耿勝榮等[19]報道的方法略微調(diào)整，將小米谷蛋白及醇溶蛋白分別溶于蒸餾水和65%乙醇中，配成50 μg/mL的蛋白溶液，攪拌過夜，靜置待不溶性顆粒沉淀，各取1滴上清液滴于新剝離的云母片(長和寬均為1.0 cm)上，待液體揮發(fā)晾干后備用。在制備樣品的過程中，應(yīng)保證避免各種污染，同時確保掃描準(zhǔn)確、探針清潔。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

小米醇溶蛋白與谷蛋白的SDS-PAGE鑒定見圖1。從圖1可以看到，分離得到的小米醇溶蛋白在11～25 kDa有3條明顯的條帶，由此判斷小米醇溶蛋白的分子量均在11～25 kDa；小米谷蛋白在11～180 kDa均有分布，且15～17 kDa 及25～35 kDa的條帶顏色較深，由此推斷此分子量范圍的小米谷蛋白含量較高。

a. 小米醇溶蛋白 b. 小米谷蛋白

2.2 圓二色光譜分析

190～240 nm紫外波段的CD圖譜能夠映射出生物大分子(如蛋白質(zhì)等)的主鏈結(jié)構(gòu)特征，能反應(yīng)出包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等二級結(jié)構(gòu)的光譜疊加特性。據(jù)文獻(xiàn)[20]可知，在190 nm處存在正峰，同時在208，220 nm 處有負(fù)峰，則表明該分子具有α-螺旋構(gòu)象；216 nm處呈負(fù)峰且185～200 nm存在正峰，表明有β-折疊構(gòu)象；在206 nm處出現(xiàn)正峰意味著存在β-轉(zhuǎn)角構(gòu)象；另外，在198 nm附近有負(fù)峰，220 nm處有小且較平的正峰，表明存在無規(guī)卷曲構(gòu)象。醇溶蛋白和谷蛋白的CD擬合圖見圖2，利用分析軟件運(yùn)算得到2種蛋白二級結(jié)構(gòu)的相關(guān)數(shù)據(jù)，見表1。

α-螺旋和β-折疊反映的是蛋白質(zhì)分子的有序性，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲反映的是蛋白質(zhì)分子松散程度。表1顯示，小米醇溶蛋白中α-螺旋含量>40%而β-折疊幾乎沒有，由此可以判斷小米醇溶蛋白屬于全α型[21]結(jié)構(gòu)，相比于小米醇溶蛋白，小米谷蛋白的α-螺旋和β-折疊含量較少而β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲含量較多，由此可見小米醇溶蛋白的有序性優(yōu)于小米谷蛋白。

1. 小米醇溶蛋白 2. 小米谷蛋白

%

2.3 X射線衍射分析(XRD)

采用X射線衍射技術(shù)研究小米醇溶蛋白與谷蛋白的晶體狀態(tài)及差異，結(jié)果見圖3、4。從圖3、4可以看到，醇溶蛋白與谷蛋白均沒有明顯增強(qiáng)的衍射峰，由此推斷2種分離蛋白是無定型的。

2.4 原子力顯微鏡分析(AFM)

圖5是小米醇溶蛋白及谷蛋白溶解液原子力顯微鏡的二維圖和三維圖。從圖5中能夠清晰地觀察到2種蛋白的聚集度及表面形態(tài)。小米醇溶蛋白呈分散狀態(tài)，顆粒大小較均勻，表面凸起平緩，直徑多在430～650 nm，最高高度只有8 nm；小米谷蛋白顆粒大小參差不齊，聚集度高，且表面凸起較高，最高高度有16.4 nm。結(jié)果表明，小米醇溶蛋白分布均衡且尺寸較小，而小米谷蛋白的大小多樣，且分布雜亂無序，與本試驗(yàn)SDS-PAGE分析和CD分析結(jié)果一致。

圖3 小米醇溶蛋白XRD圖譜

圖4 小米谷蛋白XRD圖譜

圖5 小米醇溶蛋白及谷蛋白的AFM圖

3 結(jié)論

小米醇溶蛋白和谷蛋白在結(jié)構(gòu)上存在較大差異。SDS-PAGE結(jié)果表明，小米醇溶蛋白在11～25 kDa有3條譜帶，17 kDa處譜帶明顯，而小米谷蛋白在高分子量和低分子量范圍內(nèi)都有譜帶，由此可知小米醇溶蛋白的組成較為簡單，且分子量較小，而小米谷蛋白在高分子量和低分子量范圍內(nèi)均有分布，且分子量為15～17 kDa和25～35 kDa的蛋白質(zhì)含量較高。經(jīng)XRD分析，小米中的醇溶蛋白和谷蛋白皆為無定型結(jié)構(gòu)。圓二色光譜法測定了2種蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明小米醇溶蛋白屬于全α型結(jié)構(gòu)，有序性優(yōu)于小米谷蛋白，此結(jié)果在原子力顯微鏡分析中也得以驗(yàn)證。