王國旗，唐佩福

解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853

流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是皮膚軟組織感染的常見致病菌之一，皮膚軟組織感染患者中有8.3% ～ 11.1%為銅綠假單胞菌感染[1-2]。最新研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌感染在院內(nèi)感染患者中占據(jù)相當(dāng)比例，并且有上升趨勢(shì)，尤其是在骨科嚴(yán)重創(chuàng)傷及截肢患者中[3-5]。銅綠假單胞菌在創(chuàng)面8 h即可形成生物膜并且其引起的創(chuàng)面炎癥反應(yīng)明顯強(qiáng)于較為常見的金黃色葡萄球菌[6-7]。我們?cè)缜把芯堪l(fā)現(xiàn)，與常壓環(huán)境相比，體外負(fù)壓環(huán)境下銅綠假單胞菌毒素產(chǎn)量減少、運(yùn)動(dòng)能力受到限制，體內(nèi)負(fù)壓創(chuàng)面療法可以減少創(chuàng)面細(xì)菌數(shù)量[8-9]。然而，創(chuàng)面的愈合不僅受到外界細(xì)菌數(shù)量和毒素的影響，創(chuàng)面愈合過程中自身局部炎性因子表達(dá)變化也是影響創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵因素。因此，炎性因子表達(dá)變化的探索也可能會(huì)揭示創(chuàng)面愈合的相關(guān)機(jī)制。IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α是感染過程中重要的炎性因子，能夠反映感染程度并調(diào)控激活重要免疫細(xì)胞，其中IL-8和TNF-α具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用[10-13]。本研究對(duì)負(fù)壓創(chuàng)面療法與常規(guī)無菌紗布治療銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面的局部炎癥反應(yīng)及炎性因子表達(dá)進(jìn)行比較，并對(duì)銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面中性粒細(xì)胞進(jìn)行分層計(jì)數(shù)，以深入探索負(fù)壓創(chuàng)面療法對(duì)感染創(chuàng)面局部免疫表達(dá)及炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的影響。

材料和方法

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取巴馬香豬18只，購自解放軍醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，體質(zhì)量15 kg左右，雌性，術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

2銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面的模型建立 常規(guī)麻醉、瑪貝拉脫毛膏脫毛、消毒，然后在巴馬香豬背部建立一個(gè)直徑50 mm深達(dá)肌肉層的軟組織創(chuàng)面，去除肌肉腱膜，充分止血后接種0.5 ml(總菌量約為5×107CFU)銅綠假單胞菌菌液，涂抹均勻，半透明膜敷料覆蓋24 h，以確保細(xì)菌的穩(wěn)定黏附和定植。

3分組及處理 半透明膜敷料覆蓋24 h后(建模成功，0 d)將巴馬香豬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(負(fù)壓創(chuàng)面療法)和對(duì)照組(無菌紗布)并分別進(jìn)行治療。每天密切觀察敷料變化情況，每2 d更換敷料1次。負(fù)壓創(chuàng)面療法組敷料購自武漢維斯第公司，對(duì)照組紗布為臨床常用無菌紗布。整個(gè)治療過程中兩組未采用抗生素等其他治療措施。分別于0 d、4 d、8 d、12 d、16 d定量檢測(cè)創(chuàng)面大小，充分麻醉后切取創(chuàng)面肌肉組織2塊(每4 d取材1次)，大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，重量不低于200 mg，取材時(shí)注意標(biāo)記創(chuàng)面?zhèn)?。用于炎性因子表達(dá)水平檢測(cè)的標(biāo)本保存于-80℃冰箱中，用于組織病理學(xué)檢測(cè)的標(biāo)本保存于10%中性甲醛溶液中。

4熒光定量PCR檢測(cè)創(chuàng)面炎性因子表達(dá) IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)變化采用熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。首先提取總RNA，然后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后按照熒光定量PCR說明書分別加入反應(yīng)試劑、引物、提取的總RNA樣品等進(jìn)行PCR反應(yīng)。熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理方法：變化的倍數(shù)(fold change)＝2-ΔΔCT；ΔΔCT=(CT靶基因-CT內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)對(duì)照組。

5HE染色和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 將在10%中性甲醛溶液中固定好的標(biāo)本逐級(jí)脫水，然后經(jīng)二甲苯等處理，石蠟包埋。切片時(shí)按照從創(chuàng)面表面?zhèn)鹊缴畈康姆较蚯?。切片?jīng)烘烤、脫蠟、二甲苯、乙醇水化、蘇木精染色、伊紅乙醇染料染色、脫水、封片等步驟完成HE染色。中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)按照早前Bassetto等[14]的研究方法將HE切片從創(chuàng)面表面至深部分為三層，按照表面到深部的順序依次定義為淺層 (0 ～ 1.5 mm)、中層 (2.0 ～ 3.5 mm)、深層(4.0 ～ 6.0 mm)。在每一個(gè)層次中隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，對(duì)視野范圍內(nèi)的所有中性粒細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。采用兩因素重復(fù)測(cè)量資料的方法分析方法對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行比較，事后檢驗(yàn)采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1創(chuàng)面IL-1β的表達(dá) 治療前4 d負(fù)壓創(chuàng)面療法組和對(duì)照組IL-1β表達(dá)水平均呈上升趨勢(shì)，但第4天時(shí)兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第8天后負(fù)壓創(chuàng)面療法組IL-1β表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)。到治療的第16天兩組IL-1β表達(dá)水平已降落至造模初期。見圖1。

2創(chuàng)面IL-6的表達(dá) 治療第4天對(duì)照組IL-6表達(dá)水平高于負(fù)壓創(chuàng)面療法組(P＜0.01)。治療第8天兩組IL-6表達(dá)水平達(dá)最高峰，此后開始下降。治療第12天和第16天負(fù)壓創(chuàng)面療法組表達(dá)水平依然低于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)。見圖2。

3創(chuàng)面IL-8的表達(dá) 與IL-6類似，在治療第4天兩組IL-8表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而與IL-6不同的是IL-8在整個(gè)治療期間均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而且在治療第8、12、16天負(fù)壓創(chuàng)面療法組表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P均＜0.01)。見圖3。

4創(chuàng)面TNF-α的表達(dá) 與建模初期相比負(fù)壓創(chuàng)面療法組TNF-α表達(dá)水平逐漸下降；而對(duì)照組在治療第8天呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，第8天達(dá)到頂峰，之后開始下降。治療第8天及以后負(fù)壓創(chuàng)面療法組TNF-α表達(dá)水平均低于對(duì)照組。見圖4。

圖 1 兩組創(chuàng)面IL-1β表達(dá)水平比較(aP＜0.01， vs 對(duì)照組)Fig. 1 Comparison of relative expression of IL-1β between two groups (aP＜0.01, vs control group)

圖 2 兩組IL-6表達(dá)水平對(duì)比(aP＜0.05， bP＜0.01， vs 對(duì)照組)Fig. 2 Comparison of relative expression of IL-6 between two groups (aP＜0.05, bP＜0.01, vs control group)

圖 3 兩組IL-8表達(dá)水平對(duì)比(aP＜0.01， vs 對(duì)照組)Fig. 3 Comparison of relative expression of IL-8 between two groups (aP＜0.01, vs control group)

圖 4 兩組TNF-α表達(dá)水平對(duì)比(aP＜0.01， vs 對(duì)照組)Fig. 4 Comparison of relative expression of TNF-α between two groups (aP＜0.01, vs control group)

5創(chuàng)面中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 在中層和深層兩種治療方法中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且隨著治療時(shí)間的延長變化不大。而在淺層，建模成功(0 d)至治療第4天兩組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，但負(fù)壓創(chuàng)面療法組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯少于對(duì)照組(P＜0.01)。而治療第4天之后兩組計(jì)數(shù)均開始下降，實(shí)驗(yàn)組治療的第8、12、16天時(shí)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于對(duì)照組(P均＜0.01)。分層示意圖及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見圖5。

圖 5 兩組不同層次組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的定量分析，其中NPWT-1，-2及-3分別代表淺層、中層、深層(aP＜0.01，NPWT-1 vs control-1)Fig. 5 Comparison of neutrophil count in different layers between two groups, NPWT-1,-2 and -3 represent the superf i cial layer,intermediate layer and deep layer, respectively (aP＜0.01,NPWT-1 vs control-1)

討 論

軟組織感染后創(chuàng)面要經(jīng)歷復(fù)雜細(xì)胞因子分泌過程以調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫，感染過程中的免疫應(yīng)答需要細(xì)胞間、細(xì)胞和細(xì)胞因子間的相互作用和調(diào)控。在感染早期多以固有免疫為主，而中性粒細(xì)胞是固有免疫的重要細(xì)胞，它會(huì)從血管內(nèi)向損傷處聚集，這個(gè)過程中需要借助多種細(xì)胞因子的調(diào)控。

IL-1β是一種趨化因子，會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞募集和促炎因子擴(kuò)增，從而清除銅綠假單胞菌。因此，在銅綠假單胞菌被清除后創(chuàng)面IL-1β表達(dá)水平下降[15]。IL1-β由活化的單核巨噬細(xì)胞分泌并通過激活I(lǐng)L-1受體促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集，以此加強(qiáng)感染部位的免疫對(duì)抗[16]。本研究中治療的第4天兩組IL-1β表達(dá)水平明顯高于建模初期，這明顯有助于中性粒細(xì)胞的募集，進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)銅綠假單胞菌清除。兩組治療第4天以后IL-1β表達(dá)水平開始下降。實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)少于對(duì)照組，說明此時(shí)實(shí)驗(yàn)組炎癥反應(yīng)相對(duì)較輕。中層和深層中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示細(xì)菌感染創(chuàng)面后炎癥反應(yīng)未波及到中層和深層組織，在治療過程中中性粒細(xì)胞的變化主要集中在創(chuàng)面的淺層。

IL-6是感染早期監(jiān)測(cè)的重要指標(biāo)之一，常用于新生兒感染以及膿毒癥的監(jiān)測(cè)，其表達(dá)水平反映了炎癥反應(yīng)強(qiáng)度[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)在治療的前8 d兩組IL-6表達(dá)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，之后開始下降，而整個(gè)過程中負(fù)壓創(chuàng)面療法組表達(dá)水平相對(duì)較低，提示負(fù)壓創(chuàng)面療法組炎癥反應(yīng)相對(duì)較輕，這與創(chuàng)面中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)一致。IL-8是由單核巨噬細(xì)胞以及上皮細(xì)胞分泌的小分子蛋白，也具有一定的趨化和激活中性粒細(xì)胞的作用[19-20]，有研究報(bào)道IL-8對(duì)表皮細(xì)胞的角化具有一定作用[21-22]。兩種治療方法下IL-8均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而且負(fù)壓創(chuàng)面療法組表達(dá)水平相對(duì)更高。可能原因：1)盡管IL-8表達(dá)水平與兩組創(chuàng)面炎癥反應(yīng)程度相反，但現(xiàn)有研究并不清楚其在趨化中性粒細(xì)胞的因子中發(fā)揮作用的比例，其表達(dá)水平可能解釋不了創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度變化；2)IL-8也可能在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮了作用。TNF-α作為一種促進(jìn)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子廣泛參與到感染過程中炎癥反應(yīng)的各個(gè)階段，也可以起到連接固有免疫和獲得性免疫的作用[23]。然而不同濃度的TNF-α發(fā)揮不同的作用，當(dāng)其濃度過高時(shí)可以刺激NF-κB(核轉(zhuǎn)錄因子)，影響中性粒細(xì)胞的正常凋亡，還可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致局部中性粒細(xì)胞聚集損傷正常組織[24]。本研究中早期對(duì)照組TNF-α表達(dá)升高，這一現(xiàn)象與創(chuàng)面明顯出現(xiàn)壞死組織相符，而負(fù)壓創(chuàng)面療法組則保持模型建立初的水平，在治療第8天后開始下降。在整個(gè)治療過程中實(shí)驗(yàn)組表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。其可能原因：1)模型建立成功時(shí)是感染明確形成的標(biāo)志，此時(shí)創(chuàng)明炎癥反應(yīng)相對(duì)強(qiáng)烈，在隨后的治療中負(fù)壓組創(chuàng)面細(xì)菌、生物膜成分快速被清除，可能避免了炎癥反應(yīng)的進(jìn)一步加強(qiáng)，也不需要更多的促炎因子釋放和參與；2)負(fù)壓創(chuàng)面療法可能抑制了促炎因子的表達(dá)與釋放，進(jìn)而表現(xiàn)為創(chuàng)面炎性因子表達(dá)水平相對(duì)較低。

中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示早期兩組計(jì)數(shù)均高于建模初期，且對(duì)照組更高。此時(shí)正是中性粒細(xì)胞發(fā)揮作用的時(shí)期，創(chuàng)面會(huì)出現(xiàn)局部軟組織壞死，對(duì)照組更為明顯。然而負(fù)壓創(chuàng)面療法可以通過引流作用將分泌物及壞死物質(zhì)及時(shí)引流走，最大程度保持創(chuàng)面的清潔，而對(duì)照組只能在每次更換敷料時(shí)獲得一次清潔。之后兩組中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均下降，而且實(shí)驗(yàn)組下降更快，說明實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面炎癥反應(yīng)相對(duì)較弱，間接反映了創(chuàng)面的清潔程度，這也與細(xì)菌計(jì)數(shù)一致。而另一個(gè)原因可能是負(fù)壓創(chuàng)面療法對(duì)創(chuàng)面新生肉芽組織的刺激作用，這個(gè)加強(qiáng)了創(chuàng)面的再生，避免了炎癥的持續(xù)。

早前研究表明，NPWT產(chǎn)生的負(fù)壓作用可以影響宿主細(xì)胞的生理變化，如改變骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的基因調(diào)控和表達(dá)水平、抑制BMSCs增殖活動(dòng)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，NPWT的負(fù)壓作用可以抑制IL-1β和TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)IL-6和IL-8的表達(dá)。可能原因：1)負(fù)壓的物理刺激作用改變了創(chuàng)面細(xì)胞的生理活動(dòng)，從而出現(xiàn)炎性因子的表達(dá)變化；2)負(fù)壓創(chuàng)面療法治療時(shí)的引流作用可以將創(chuàng)面過多的分泌物和非定植的細(xì)菌及時(shí)引流至體外，減少了引起炎癥反應(yīng)的刺激物。上述因子表達(dá)變化的結(jié)果導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)組淺層創(chuàng)面中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相對(duì)較少，減輕了感染狀態(tài)下的過度炎癥反應(yīng)。

本研究也存在不足之處，首先，未對(duì)負(fù)壓環(huán)境下不同細(xì)胞因子之間的相互調(diào)節(jié)和作用進(jìn)行深入探討。其次，僅檢測(cè)部分炎性因子的表達(dá)水平。

綜上，與傳統(tǒng)無菌紗布治療相比，負(fù)壓創(chuàng)面療法促進(jìn)部分炎性因子的表達(dá)，利于創(chuàng)面早期調(diào)動(dòng)免疫反應(yīng)，同時(shí)抑制促炎因子的過度表達(dá)，改善創(chuàng)面的過度炎癥反應(yīng)。