李 朋，王勤章，錢 成，徐 浩，申茂磊，郝志強(qiáng)，錢 彪

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，新疆石河子 832000

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見(jiàn)的疾病之一，其中腎結(jié)石比較多見(jiàn)，但腎結(jié)石的形成機(jī)制和發(fā)病原因目前仍未完全明確。腎部位的結(jié)石主要為草酸鈣等含鈣結(jié)石[1-2]，有研究表明鈣的代謝異常是導(dǎo)致含鈣尿路結(jié)石形成的重要因素之一，高鈣尿引起尿液相對(duì)過(guò)飽和誘發(fā)了含鈣結(jié)石的形成[3]。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)會(huì)使腎小管髓袢升支粗段鈣的重吸收受到抑制，尿鈣排泄率增加，進(jìn)而形成高鈣尿誘發(fā)了含鈣結(jié)石的形成[4-6]。我們推測(cè)CaSR在大鼠腎草酸鈣結(jié)石的形成過(guò)程中起著非常重要的作用。本研究對(duì)CaSR在草酸鈣結(jié)石形成過(guò)程中表達(dá)水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，對(duì)其在結(jié)石形成中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

材料和方法

1材料 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠60只，6周齡左右，體質(zhì)量(210±15) g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)SCXK(新)2013-0001]。多功能光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(BX40，日本Olympus公司)，CaSR抗體(英國(guó)Abcam公司)。

2大鼠腎結(jié)石模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 參照孫穩(wěn)[7]的方法制作大鼠腎結(jié)石模型。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠分為空白對(duì)照組與結(jié)石組，每組各30只?？瞻讓?duì)照組給予正常飲水每日每只2 ml灌胃2周；結(jié)石組給予1%乙二醇飲水和2%氯化銨每日每只2 ml灌胃2周。1 ～ 10周每組每周處死3只大鼠并取其雙側(cè)腎標(biāo)本。

3腎組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 連續(xù)10周肉眼觀察大鼠腎形狀、體積大小以及顏色變化；兩側(cè)腎各取一部分組織用甲醛液固定，石蠟包埋后使用解剖顯微鏡進(jìn)行大體形態(tài)及結(jié)石晶體形成觀察。

4腎組織HE染色 將一部分石蠟包埋后的腎組織標(biāo)本制成切片，將切片固定于載玻片上，常規(guī)HE染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)晶的形成情況及腎病理改變，并按照文獻(xiàn)[8]提供的腎結(jié)晶分級(jí)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，0級(jí)判定為陰性結(jié)果，表示腎組織內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶形成；Ⅰ～Ⅳ級(jí)判定為陽(yáng)性結(jié)果，分別表示腎組織內(nèi)結(jié)晶形成的程度。

5免疫組織化學(xué)檢測(cè)CaSR的表達(dá) 選取成功建立模型的另一部分腎組織做免疫組織化學(xué)染色。免疫組化采用SP法，石蠟包埋后切片4μm，常規(guī)脫蠟，H2O2處理清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)，血清封閉。滴加CaSR抗體(1∶150)，4℃孵育過(guò)夜，滴加二抗，DAB顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染，不同濃度乙醇和二甲苯脫水，樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察1 ～ 10周兩組Wistar雄性大鼠腎CaSR免疫組織化學(xué)染色情況。

結(jié) 果

1腎組織HE染色病理改變 光學(xué)顯微鏡下觀察，造模期間正常對(duì)照組大鼠腎組織冷凍切片內(nèi)未見(jiàn)結(jié)晶沉積，無(wú)病理學(xué)改變(圖1A)。第2周起結(jié)石組部分大鼠腎可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞脫落或腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及數(shù)量不等透明晶體，多數(shù)晶體以不規(guī)則碎片出現(xiàn)于腎小管中，部分見(jiàn)于集合管、間質(zhì)及被膜下，并伴有部分腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞空泡樣變性及小管上皮腫脹；第5 ～ 10周腎組織結(jié)晶量多，細(xì)胞排列紊亂，腎小管多畸形，腎小管管腔擴(kuò)大或因上皮細(xì)胞腫脹而變窄，擴(kuò)大腔內(nèi)多有壞死脫落樣物，腎小球多形狀不規(guī)則甚至壞死，以腎小管內(nèi)為著(圖1B)。

2腎結(jié)晶形成情況及分級(jí) 正常對(duì)照組大鼠腎組織未見(jiàn)結(jié)晶。第3周起結(jié)石組大鼠腎切片可見(jiàn)明亮晶體，主要分布于遠(yuǎn)曲小管，近曲小管及部分腎小球周圍，形態(tài)不規(guī)則，晶體多呈零星散在分布，少量晶體呈互相連接成片或成堆，結(jié)石組與正常對(duì)照組之間成石率(因結(jié)石組大鼠在第3周開(kāi)始成石，而前兩周已處死的大鼠也存在成石的可能，所以在計(jì)算成石率時(shí)將兩組內(nèi)前兩周已處死的大鼠排除在大鼠總計(jì)數(shù)之外)見(jiàn)表1。

圖 1 第9周兩組大鼠腎組織HE染色對(duì)比(HE×200) A：對(duì)照組；B： 結(jié)石組Fig. 1 Comparison of HE staining in renal tissue at the 9th week in both groups (HE×200) A: control group; B: calculi group

3腎組織CaSR免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下觀察到第1 ～ 2周結(jié)石組與對(duì)照組大鼠腎組織均有CaSR的表達(dá)但沒(méi)有明顯差異，主要定位于腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，呈棕褐色。第3 ～ 10周對(duì)照組大鼠腎組織CaSR的表達(dá)較第1 ～ 2周無(wú)明顯變化，結(jié)石組大鼠腎組織CaSR的表達(dá)強(qiáng)度則逐漸增強(qiáng)且明顯高于對(duì)照組，鏡下可見(jiàn)結(jié)石組腎組織CaSR呈高度表達(dá)且彌漫分布。見(jiàn)圖2。

表1 兩組大鼠腎組織結(jié)晶分級(jí)Tab. 1 Grading of crystallization in two groups

討 論

泌尿系結(jié)石以草酸鈣等含鈣結(jié)石最為多見(jiàn)[9-11]。尿液中游離鈣增高是泌尿系結(jié)石形成的主要危險(xiǎn)因素[12-14]。鈣敏感受體是G蛋白偶聯(lián)受體家族的一員，在調(diào)節(jié)全身Ca2+動(dòng)態(tài)平衡中起主要作用[15-16]。有研究表明，CaSR在腎表達(dá)于腎小管髓袢升支粗段[17]，激活后通過(guò)改變細(xì)胞旁途徑的滲透性來(lái)降低腎小管髓袢升支粗段對(duì)鈣的重吸收。據(jù)此我們推測(cè)，CaSR在腎草酸鈣結(jié)石的形成過(guò)程中起著重要的作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)第1 ～ 2周結(jié)石組與對(duì)照組大鼠腎組織病理改變無(wú)差異，免疫組化顯示兩組大鼠腎組織CaSR表達(dá)水平無(wú)明顯差異。第3周開(kāi)始，結(jié)石組大鼠腎體積逐漸增大，顏色漸漸變淺和發(fā)白，皮髓結(jié)構(gòu)不清晰，且在皮髓交界處可見(jiàn)淡黃色顆粒沉積，觸之有沙粒樣感覺(jué)；HE染色可見(jiàn)結(jié)石組大鼠腎切片有明亮晶體；免疫組化觀察到第3 ～ 10周結(jié)石組CaSR的表達(dá)程度逐漸增強(qiáng)且明顯高于對(duì)照組。而第3 ～ 10周對(duì)照組大鼠腎組織的HE染色結(jié)果以及腎組織中CaSR的表達(dá)水平與第1 ～ 2周相比并未發(fā)生明顯改變。因此筆者認(rèn)為CaSR表達(dá)水平在大鼠腎組織含鈣結(jié)石的形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，可能是通過(guò)腎組織CaSR激活CaSR-緊密連接蛋白-14(Claudin-14)通路，Claudin-14高度表達(dá)能夠阻斷由Claudin-16和Claudin-19構(gòu)成的細(xì)胞外陽(yáng)離子通道，使細(xì)胞旁途徑的滲透性發(fā)生改變，從而降低了腎小管髓袢升支粗段對(duì)鈣的重吸收，Ca2+排泄增加，尿路中游離鈣增多，促進(jìn)了含鈣結(jié)石的形成[18-19]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CaSR的表達(dá)強(qiáng)度在大鼠草酸鈣結(jié)石形成過(guò)程中存在動(dòng)態(tài)改變，在結(jié)石形成過(guò)程中起著非常重要的作用，之后將進(jìn)一步探討泌尿系含鈣結(jié)石的形成機(jī)制，為臨床治療提供有力依據(jù)。